重组DNA技术及人类基因组研究基因工程诞生的历史背景

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同功异源酶
来源不同的限制酶,能识别和切割同一位点,这些酶 称为同功异源酶.
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切 割DNA后会产生相同的粘性末端，称为同尾酶。 这两个相同的粘性末端成为配伍末端 （compatible end)
(三)目的基因
基因工程（genetic engineering）：实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称为基因 工程，又称重组DNA工艺学 目的 a分离获得感兴趣的基因或DNA b获得感兴趣的基因表达产物
（二）重组DNA技术中常用的工具酶
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列，并在识别位点或 其周围切割双链DNA的一类内切酶 分类：I, II, III类基因工程常用II类 作用:与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系 统,限制外源DNA,保护自身DNA
命名方式
II类酶识别序列特点
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限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异 识别的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这 种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷 酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末 端、配伍末端。 。
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质粒
能在宿主细胞内独立 自主复制;带有某些遗 传信息,会赋予宿主细 胞一些遗传性状
二重组DNA技术基本原理
以 质 粒 为 载 体 的 克 隆 DNA
（一）目的基因的获取
化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 基因组DNA库（genomic DNA library） cDNA文库(cDNA library) PCR反应
化学合成法获得目的基因
从基因组文库获取目的基因
存在于转化细胞内由 克隆载体所携带的所 有基因DNA的集合
从cDNA文库获取目的基因
（二）克隆载体的选择和构建
载体容量 合适的克隆位点 载体的稳定性
(三）外源基因与载体的连接
粘性末端连接： 1. 同一限制内切酶酶切点连接 2. 不同限制内切酶酶切点连接 配伍末端和非配伍末端
一、重组DNA技术相关概念
(一)DNA 克隆 克隆（clone）: 来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化 （cloning）,即无性繁殖。
技术水平： 分子克隆（molecular clone）：即DNA克隆 细胞克隆：个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质与载体DNA连接成具有自我复制能 力的DAN分子，继而通过转化或转染宿主 细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子， 也称为基因克隆或重组DNA
5. 染色体外DNA----质粒的深入研究，为第一批 重组DNA载体提供了材料。 6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化， 为DNA的体外重组提供了有力的工具。 7. 1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶 EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两 种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合 DNA分子。 至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试 在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为 生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也 迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研 究领域。
重组DNA技术 及人类基因组研究
基因工程诞生的历史背景：
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证明了 DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人提出了 DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复 制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传 密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传 信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白 质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基 因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合 成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双 链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞 或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有 DNA序列。
同 一 内 切 酶 酶 切 位 点 连 接
配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割wenku.baidu.com点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
（四）基因载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子 载体选择标准 可转移性 合适的复制位点 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA
常用载体
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体成为克 隆载体。 表达载体（expression vector)：为使插入 的外源DNA序列可以转录翻译成多肽链而 特意设计的载体成为表达载体。
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
配伍末端的连接 情况和同一限制 酶切位点连接相 似。
重组体
平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端