血清转氨酶(GPT、GOT)活性的测定
血清谷丙转氨酶测定
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COOH
C NH2 CH3 Ala
COOH
COOH
谷丙转氨酶
+ CO
CO
(CH2)2
CH3
COOH
丙酮酸
α-KG
COOH + C NH2
(CH2)2 COOH
Glu
NO2
COOH CO
+ H2N
HN
NO2
CH3
2，4-二硝基苯肼
0
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COOH
NO2
C N HN
CH3
NO2
丙酮酸-2，4-二硝基苯腙 棕红色，520nm处具特征光 吸收，颜色深浅（OD520值） 与丙酮酸含量成正比，可据
transaminase GOT
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–当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿
胀、坏死导致大量的酶释放到血流中，从而引起血清谷
丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶(GOT)活性显著升高。因
此测定这些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的
参考价值。
本试验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物 (基质液 成分)经血清谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及丙酮酸。丙
28
57
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2,4-二硝基苯肼 ml
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37℃水浴保温 20min
氢氧化钠 ml
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5.0
5.0
5.0
室温下静置10min
0号管调零，于520nm处测吸光度
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GPT活力测定：洁净干燥试管2支， 即测定管、对照管各1支
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四、实验操作
转氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解转氨酶在生物体内的重要作用及其在临床诊断中的意义。
2. 掌握转氨酶活力测定的原理和方法。
3. 培养实验操作技能，提高分析问题的能力。
二、实验原理转氨酶（Transaminase）是一类催化氨基酸与α-酮酸之间氨基转移的酶。
在生物体内，转氨酶在氨基酸的合成与分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中发挥着重要作用。
谷丙转氨酶（GPT，ALT）和谷草转氨酶（GOT，AST）是常见的两种转氨酶，其中GPT和GOT活性测定在临床上具有重要意义。
本实验采用连续监测法测定谷丙转氨酶活力。
在实验过程中，GPT催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和谷氨酸。
生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，呈棕色。
通过测定棕色溶液的吸光度，可计算出酶的活力。
三、实验材料1. 实验试剂：谷丙转氨酶试剂盒、丙氨酸、α-酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、氢氧化钠、盐酸、蒸馏水等。
2. 实验仪器：紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制：按照试剂盒说明书配制标准溶液，分别测定不同浓度标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。
2. 酶活力测定：取一定量的丙氨酸、α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼，按照实验方法配制反应体系。
将反应体系放入恒温水浴锅中，在一定温度下反应一定时间。
然后加入氢氧化钠终止反应，测定反应体系中丙酮酸2，4-二硝基苯腙的吸光度。
3. 计算酶活力：根据标准曲线和测得的吸光度，计算出酶活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，得到线性方程。
2. 酶活力测定：按照实验步骤测定酶活力，得到实验结果。
3. 结果分析：将实验结果与正常值进行比较，分析实验结果的可靠性。
六、实验结论1. 本实验成功测定了谷丙转氨酶的活力，实验结果可靠。
2. 谷丙转氨酶活力测定在临床诊断中具有重要意义，可用于检测肝脏疾病、心肌梗死等疾病。
3. 本实验提高了实验操作技能，培养了分析问题的能力。
血清GPT活性测定
方法学评价： 血清中也含有酮酸及LDH，可以消耗 NADH而使测定结果偏高。 对策：采用过量的NADH（终浓度 0.14~0.2mmol/L），将血清同不含α-酮戊二酸 的所有试剂一起预温，使其他副反应充分进行， 再加入α-酮戊二酸以启动酶反应，监测光吸收 的变化，可完全排除这种干扰。
Hale Waihona Puke 定时比色法临床意义 ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标。 1、急性病毒性肝炎，可观察病情发展，作预后 判断。 2、慢性病毒性肝炎或脂肪肝，正常或轻度增高。 3、肝硬化、肝癌时，ALT轻度或中度增高，提 示可能并发肝细胞坏死。 4、其它原因引起的肝脏损害、骨骼肌损伤、多 发性肌炎等亦可引起ALT增高。
注意事项 1、严重脂血症或黄疸血清可使测定管吸光度明 显增加，检测此类标本时，应作血清对照管。 2、加入2，4-二硝基苯肼溶液后应充分混匀，使 反应完全，否则影响重复性。 3、呈色物质配制必须准确。 4、应使用外观洁白、干燥的高纯度丙酮酸钠。 5、标本测定值超过150酶活力单位时，应用生理 盐水稀释后再测。
血清丙氨酸氨基转移酶测定 (alanine aminotransferase, ALT)
测定方法： 定时比色法（两点法） 酶联-紫外连续监测法（动力学法或速率法）
酶联-紫外连续监测法 酶联 紫外连续监测法
原理： L-丙氨酸+α-酮戊二酸 酸
LD
ALT
丙酮酸+L-谷氨
丙酮酸+NADH L-乳酸+NAD+ 在340nm连续监测NADH的消耗量，从而计算 出ALT的活力。
赖氏法原理： 赖氏法原理： 丙酮酸和α-酮戊二酸在血清ALT的作用下生成 丙酮酸和谷氨酸，在酶反应到达规定时间内，加入 溶于酸的2，4-二硝基苯肼终止酶反应，并分别与产 物丙酮酸和剩余底物α-酮戊二酸生成相应的二硝基 α苯腙，在碱性条件下均呈红棕色，二者吸收光谱在 505nm处差异最大，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α酮戊二酸苯腙的3倍，据此可算出丙酮酸的生成量， 推算出ALT的酶活力。
谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的测定
谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的测定（一）主要仪器与试剂1.主要仪器设备高速离心机, 恒温水浴锅,722G 分光光度计2.主要试剂(1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2)：0.2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24.2g 三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml 和0.2mol/L HCl 44.2ml , 用蒸馏水稀释至200ml。
(2)0.1mol/L 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g, 磷酸二氢钾(AR)2.176g, 加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(3)2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4 -二硝基苯肼19.8mg, 用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml , 保存于棕色瓶中备用, 此液可保存3 个月。
(4)0.4mol/L 氢氧化钠溶液：16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(5)1mol/L氢氧化钠溶液：40g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(6)丙酮酸标准液(2μmol/ml)：精确称取纯丙酮酸钠22.0mg 于100ml 容量瓶中, 加0.1mol/L 磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制。
(7)GOT 底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L)：称取α-酮戊二酸29.2mg 和DL-门冬氨酸 2.66g 置于一小烧杯中,加入1mol/L 氢氧化钠20.5ml 使溶解,并校正pH 至7.4, 然后将溶液移入100ml容量瓶内, 用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。
放置冰箱内保存。
(8)GPT 底物液：(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):称取α-酮戊二酸29.2mg 和DL-丙氨酸 1.79g置于一小烧杯中, 加入0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml 煮沸溶解后,待冷, 用1mol/L氢氧化钠调pH 至7.4(约加0.5ml), 再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml 混匀,加氯仿数滴防腐, 贮于冰箱内。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
实验教学教案首页肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识１．酶的提纯基本操作程序及基本原则２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）３．测定酶活力一般经如下几个步骤①选择适宜的一定浓度的底物。
②确定酶促反应的条件。
优化条件③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。
④反应到一定时间后取出反应液终止反应。
⑤测定产物的生成量。
⑥计算酶活力、酶的比活力。
４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标⏹每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液⏹比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。
５．总活力、纯化倍数和回收率６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。
ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。
其次是肾、心、骨骼肌、脾等。
AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。
①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。
当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。
②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。
（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑心肌梗塞：S-GOT↑↑一、实验目的１．了解转氨酶的性质及临床意义 ２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。
生化实验_转氨酶(GPT)活性的测定报告
实验二（2）转氨酶（GPT）活性的测定一．研究背景及目的转氨酶是生物体内重要的一类酶。
转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用[1]。
转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。
其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。
GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。
GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。
由于都有丙酮酸的生成，所以可以通过实验测定一定时间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。
本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。
二．原理由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。
转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。
该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃，pH7.4条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
丙酮酸含量的测定运用的是比色法。
丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。
三．材料、试剂与仪器材料：新鲜家兔肝脏和血清试剂[1]：①磷酸盐缓冲液（pH7.4）甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液乙液：1/15 mol/L磷酸氢二钾溶液取甲液825ml，乙液175ml，混合，测得pH为7.4即可。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
或 组织捣碎机 2. 37℃水浴 3. 分光光度计 4.比色皿
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 2.谷丙转氨酶底物 3.0.1M pH7.4 PB 4.0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液 5.0.4M NaOH 6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
COOH CH 2 2 C O COOH COOH CH 2 CH 2 C H N H2 COOH GPT CH
C H3 CHNH 2 COOH
C H3 C O COOH N O2 H2N H N
2,4-二硝基苯肼
CH 3 C N COOH H2 O N O2 NH
N O2 N O2
丙酮酸二硝基苯腙
3.计算
每ml肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/ml） D = （A—B）× 2 S ×2.5 说明：A：样品A 520nm B：对照A 520nm 2：标准丙酮酸浓度 2.5：谷丙转氨酶换算单位
S：标准A 520nm
五、实验步骤
试管 试剂(ml) 谷丙转氨酶底物 肝匀浆 2.4-二硝基苯肼 谷丙转氨酶底物 0.4M NaOH A 520nm 测定管 （A） 0.5 标准管 （S） 0.5 对照管 （B） —— 空白管 —— 0.1（H2O） 0.5 0.5
称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成 10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。
2. 谷丙转氨酶活力的测定
1）取4支试管，标注名称，按照下表操作 2）计算酶活力 本法规定：酶在37℃ 与底物作用30分钟，产生2.5μg 丙酮酸为一个谷丙转 氨酶活性单位。
37℃ 水浴5 分钟 0.1 0.1（标准丙酮酸） 0.1 混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟 0.5 0.5 0.5 —— —— 0.5 混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟 各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm
转氨酶测定
二硝基苯腙（黄色），进而在碱性环境中生成 取血清加入1号试管内，准确保温30min。
取2支试管并标号，用1号试管作为测定管，2好试管作为空白对照管。 酶活力（U/100mL）的计算
红棕色的苯腙硝醌化合物。 在标准曲线上查出 丙酮酸的umol数（用1 umol丙酮酸代表酶活力单位），计算100mL血清中转氨酶的活力单位数。
据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中GPT的活力。 取血清加入1号试管内，准确保温30min。 测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
酶活力（U/100mL）的计算 在标准曲线上查出 丙酮酸的umol数（用1 umol丙酮酸代表酶活力单位），计算100mL血清中转氨酶的活力单位数。 取出后向各管加入NaOH溶液5mL。 室温下静置10min，以零号管作对照,于520nm波长处测定各管光吸收值。 向2支试管各加NaOH溶液5mL。 向2支试管各加NaOH溶液5mL。 室温下静置10min，以2号管作对照,于520nm波长处测定1号管光吸收值。 其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与GPT活力的高低成正比关系。 各加入基质液，置37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。 磷酸缓冲液（）
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
【实验目的】
1.掌握转氨酶活力测定的原理和方法。 2.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
【实验原理】
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分 光光度法。血清中的谷-丙转氨（GPT），在 37℃、的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
血清GPT活力的测定
混匀，置37℃水浴20分钟 混匀，置37℃水浴20分钟
混匀，室温放置10分钟后以蒸馏水调零，用520 分钟后以蒸馏水调零， 混匀，室温放置10分钟后以蒸馏水调零 nm波长比色 读取各管吸光度。 nm波长比色，读取各管吸光度。各管的吸光度 波长比色， 减去0号管的吸光度， 减去0号管的吸光度，然后以吸光度的差值为纵 坐标，各管相应的转氨酶活力单位为横坐标， 坐标，各管相应的转氨酶活力单位为横坐标，绘 制标准曲线。为了方便， 制标准曲线。为了方便，可将各管的吸光度相当 于转氨酶的卡门氏单位列于其后。 于转氨酶的卡门氏单位列于其后。 2 酶活力的测定：取试管两支，注明测定管（T） 酶活力的测定：取试管两支，注明测定管（ 及对照管（ ），在测定前将底物液在 ℃ 在测定前将底物液在37 及对照管（C），在测定前将底物液在37℃水浴 中预温5分钟，再按下表操作。 中预温5分钟，再按下表操作。
混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零， 混匀，室温放置10min后 以蒸馏水调零， 520nm波长处比色 读取吸光度， 波长处比色， 在520nm波长处比色，读取吸光度，用T 管的吸光度减去C管的吸光度，查标准曲线， 管的吸光度减去C管的吸光度，查标准曲线， 即得到待测血清中所含ALT的酶活力。 ALT的酶活力 即得到待测血清中所含ALT的酶活力。
血清丙氨酸氨基转移 ALT）活力的测定（ 酶（ALT）活力的测定（改 良赖氏法） 良赖氏法）
同组人：陈孝炜，张极平，赖海洋 同组人：陈孝炜，张极平，
ALT酶活力单位的定义： ALT酶活力单位的定义： 酶活力单位的定义
• 1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用 1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用
•
• 丙酮酸+NADH 丙酮酸+NADH
谷丙转氨酶活性检测
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
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2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
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七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
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六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。
血清谷丙转氨酶活力测定
血清谷丙转氨酶活力测定目的和要求了解转氨酶的性质及临床意义。
掌握用测定试剂盒方法测定谷丙转氨酶（GPT或ALT）活力。
原理在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
此过程可用下式表示：本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，测定谷丙转氨酶活性。
在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α–酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。
此反应可逆，平衡点近于1。
无论正向或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α–酮酸，因此可有多种测定方法。
本实验以丙氨酸及α–酮戊二酸作为谷丙转氨酶（GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。
丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸–2，4–二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439～530nm，可用于测定丙酮酸含量。
α–酮戊二酸也能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯稍有差别，在520nm波长比色时，α–酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。
经转氨酶作用后，α–酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α–酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以籍以测定谷丙转氨酶的活力。
但是，由于在实验中不宜有过多的α–酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的α–酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶之间的关系并不始终成一直线关系。
当酶量增大时，曲线斜率减小。
因此在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。
另外，2，4二硝基苯肼对此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加α–酮戊二酸，但是丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现出直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。
动物医学-生化实验《实验八 转氨酶GPT活性的测定》课件
金氏法测定转氨酶的活性单位为：每毫 升血清与基质在37℃下作用60分钟，生 成1μmol丙酮酸为1个单位。
【 试剂 】
1．1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液。 2．GPT基质液 。 3．2，4–二硝基苯肼溶液 。 4．丙酮酸标准液（1ml = 2μmol丙酮酸
即2mmol/L）。 5．0.4 mol/L氢氧化钠溶液。 6．血清1ml 。
【 器材 】 1．水浴锅。 2．分光光度计。
【操作】 1．标准曲线制作：取6支试管按下表操作。
混匀后，用分光光度计在520nm波 长处进行比色测定，以空白调零，读取 各管吸光度读数。以各管相应的转氨酶 活性单位值为横坐标，吸光度值为纵坐 标，用坐标纸绘制标准曲线。
2．GPT测定：取2支洁净的试管按下表操作。
混匀，放置5分钟，用分光光度计在波长 520nm波长处进行比色测定，以空白调零，读 取测定管吸光度值，计算结果。
测定单位时间内丙酮酸的产量即可 得知转氨酶的活性。
丙酮酸可与2，4–二硝基苯肼反应， 形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈
棕红色，显色的深浅在一定范围内可反映 所生成的丙酮酸量多少，与同样处理的丙
酮酸标准液进行比色，计算出其含量，可 以测定转氨酶的活性。
丙酮酸 + 2，4–二硝基苯肼
丙酮
酸–2，4–二硝基苯腙（棕红色）
实验八 转氨酶GPT活性的测定
【原理】 转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–
酮酸的α–酮基之间的相互转化，从而生 成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这 种作用称为转氨基作用。
在动物机体中活力最强、分布最广的 转氨酶有两种：一种为谷氨酸草酰乙酸 转氨酶 ，另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶 。
转氨酶催化反应如下：
血清谷丙转氨酶活性的测定
2．GPT底物液
称取分析纯L-丙氨酸1.78g,α-酮戊二酸29.2mg,先用 50mL磷酸盐缓冲液溶解,然后用1mol/L NaOH校正pH 至7.4（约0.5mL）,再加磷酸盐缓冲液至100ml,加氯仿 数滴，防止变质。
3．2.0mmol/L丙酮酸标准液 4．0.4mol/L NaOH溶液 5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液
【实验原理】
ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移,生成丙酮 酸和谷氨酸,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸 2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕色，颜色的深浅与丙酮酸 含量成正比。根据丙酮酸的生成量，即可计算GPT活性的大小。 α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼反应生成相应的苯腙， 在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在520nm处 比色时，丙酮酸2,4-二硝基苯腙的光密度远比α-酮戊二酸苯腙 高。反应30min后， α-酮戊二酸量减少而丙酮酸量增加 ，在 一定范围内，520nm处光密度增加的程度与反应体系中丙酮酸 和α-酮戊二酸的摩尔比例呈线性关系。
【目的要求】
1.了解血清谷丙转氨酶活力单位的定义。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活力测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
GPT酶活力单位
卡门首先研究了GPT酶活力的测定方法，并定义了
酶的活力单位。 原理
活力单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）,在25℃1min中内生成的 丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+,在340nm处， 用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基酸转移酶活 力单位。
【操作步骤】
标准曲线绘制 取试管5支，按下表操作
肝脏谷丙转氨酶活力测定
实验教学教案首页肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识１．酶的提纯基本操作程序及基本原则２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）３．测定酶活力一般经如下几个步骤①选择适宜的一定浓度的底物。
②确定酶促反应的条件。
优化条件③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。
④反应到一定时间后取出反应液终止反应。
⑤测定产物的生成量。
⑥计算酶活力、酶的比活力。
４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标⏹每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液⏹比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。
５．总活力、纯化倍数和回收率６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。
ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。
其次是肾、心、骨骼肌、脾等。
AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。
①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。
当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。
②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。
（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑心肌梗塞：S-GOT↑↑一、实验目的１．了解转氨酶的性质及临床意义 ２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。
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血清转氨酶（GPT、GOT）活性的测定
【原理】
酶的活性即酶的催化效能，在一定条件下酶活性的高低代表酶的含量的多少，故酶活性的测定也即相当于酶含量的测定。
酶的活性通常都是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物生成量来确定的。
血清谷丙转氨酶（SGPT）及血清谷草转氨酸（SGOT）分别以丙氨酸和α-酮戊二酸；天冬氨酸和α-酮戊二酸为底物，催化它们进行如下反应：
在SGOT催化下所生成的草酰乙酸又可在β脱羧酶和枸橼酸苯胺作用下脱羧，生成丙酮酸，而丙酮酸则可与2，4二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕色，在520nm比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙之光吸收远丙酮酸二硝基苯腙为低。
在反应后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，故520nm处光密度增加之程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸之克分子比例成线性关系。
一般临床上用以测定SGPT及SGOT活性的方法有改良的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所差异。
改良的穆氏法（Mohun）规定血清在37（pH7.4）的条件下，与底物作用30分钟后，每生成2.5μg丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
金氏法（King）则规定在同上条件下，与底物作用60分钟后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
赖氏法（Reitman）本身并未对转氨酶活性单位提出规定，他是用卡门氏法（Karman）来定单位的。
卡门氏法是在紫外分光光度计中用1毫升血清，反应溶液总量为3毫升，在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，25℃ 1分钟内所产生的丙酮酸，在乳酸脱氢酶作用下，使NADH变成NAD+，而引起光密度下降0.001为1个转氨酶活性单位。
而赖氏法则是用卡门氏法所测出的单位数相当于赖氏法所产生的丙酮酸量的相关系数，套用卡门氏单位而来。
由此可见，测定同一份血清的转氨酶活性，用不同方法测算，其值不一样。
因而它们的正常值范围也可有显著差异。
赖氏法：SGPT与SGOT的正常值均在40单位以下。
金氏法：SGPT91±35.8单位；SGOT83±23.8单位
改良穆氏法：SGPT2-40单位：SGOT4-50单位
以上均以每100ml血清计
目前国内多采用赖氏法。
本实验即采用此法。
【操作】
1、标准曲线绘制：取试管6支按下表操作。
试管号对照 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液（1毫升2微克分子）0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 SGPT或SGOT底物0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
0.1M磷酸盐缓冲液PH7.4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
相当于谷丙转氨酶单位0 28 57 97 150 200
相当于谷草转氨酶单位0 24 61 114 190 —置37水浴30分钟，各管加2，4二硝基苯肼液0.5毫升，混匀，再在37℃水浴中放置20分钟，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5毫升，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之光密度，各管之光密度均减去对照管之光密度，然后以光密度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。
绘制成标准曲线。
为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。
2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。
试剂（毫升）测定对照血清0.1 0.1
SGPT或SGOT底物0.5 —
置37℃水浴30分钟（SGOT为37℃，60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴）
2.4二硝基苯肼0.5 0.5
置37℃水浴20分钟
SGPT或SGOT底物—0.5
0.4N NaOH 5.0 5.0
10分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取光密度，用测定管光密度减去对照管光密度，由标准曲线查知转氨酶活力单位。
【临床意义】
谷丙转氨酶广泛在于机体的各种组织中，但以肝脏含量最为丰富。
正常人血清中此酶活性甚低。
由本实验方法测定SGPT正常值应在40单位以下。
当肝脏有病变，特别是急性肝炎及中毒性肝细胞坏死时，血清中谷丙转氨酶活性显著增高。
在肝癌、肝癌化及胆道疾病患时，
此酶活性也可中度或轻度的增高。
另外，其它脏器或组织的疾病，如心肌梗塞时，也可见血清谷丙转氨酶活性的上升。
谷草转氨酶（正常在50单位以下）在机体以心肌含量最为丰富，其它组织如肝脏、肌肉、肾、肺亦含有此酶。
急性心肌梗塞、急性肺炎及大手术后此酶活性明显增高；另外在肝、肾、心、肺、胸膜等脏器发生炎性病变时都可见此酶活性中度或轻度的增高。
【附注】
1、不同血清对照管光密度基本相同，因此同一批标本只做2~3个血清对照管求其平均值即可，亦可作空白管来代替对照管。
但脂血，溶血，黄疸血应单独做对照管。
2、SGPT或SGOT超过200单位时，应将血清稀释后再进行鉴定，结果乘以稀释倍数。
3、酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应严重控制温度和注意掌握时间。
4、血清标本不应溶血，且最好在采血之当日进行测定，如不能当日操作者，可储于冰箱4℃中1~2天。
5、DL型丙氨酸，如改用L型丙氨酸，可减半量（因转氨酶只作用于L型丙氨酸）。
6、光密度与丙酮酸的标准线成抛物线，是因为除丙酮酸与2.4二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外，α－酮戊二酸亦能与2.4二硝基苯肼产生苯腙。
这是本实验方法的缺点。
【试剂】
1、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）13.97g及磷酸二氢钾（KH2PO4）2.69g溶解于1000ml蒸馏水中。
2、SGPT底物：称DL-丙氨酸1.79g，α-酮戊二酸29.2mg置于烧瓶内，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）约80ml煮沸溶解后，加1mol/LNaOH校正PH至7.4（约加0.1ml），再以缓冲液加到100ml。
可分装成安瓿煮沸半小时，此安瓿可保存一年，（亦可加少量氯仿在冰箱中保存数周）。
3、SGOT底物：称天门冬氨酸2.66g，α-酮戊二酸29.2mg于烧杯中，，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）约50ml煮沸溶解后，加1mol/LNaOH校正PH至7.4（约加20.5ml），再以缓冲液加到100ml。
可分装成安瓿煮沸半小时，此安瓿可保存一年（亦可加少量氯仿在冰箱中保存数周）。
4、枸橼酸苯胺溶液：取枸椽酸50g溶于50ml蒸馏水中备用，用前取枸椽酸溶液与等量体积苯胺混合即成。
5、2.4二硝基苯肼溶液：称取2.4二硝基苯肼20mg溶于1mol/LHCI中。
加热溶解后，用1mol/LHCI稀释至100ml。
6、0.4mol/LNaOH溶液
7、丙酮酸标准溶液（1ml含2微克分子）：精确称取纯丙酮酸钠22.0g于100ml容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液至刻度。
此溶液需在临用前配制。