胆固醇氧化酶法
血清总胆固醇的测定
实验原理
• 第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水 解为游离胆固醇和游离脂肪酸 。
• 第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作 用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。
• 第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在 时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚 胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅 与标本中TC含量成正比。
• 鱼类。乌鱼又称黑鱼性寒味甘，能补脾利水同时 它又是一种高蛋白低脂肪食品。青鱼性平味甘， 能补气健脾化湿。鳆鱼又称鲍鱼，肉性平味甘咸， 蛋白质含量极高，而脂肪含量很低的清补营养品。 黄鳝甘温，古代医家认为它有添精益髓，又有通 血脉、壮筋骨的作用同时它又是一种低脂食品。 另外，如黄瓜、海带、羊栖菜、海藻、槐花等食 物，均有降低血中胆固醇的效果。
试剂
• 基础液：100ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液 （pH=6.7）(含胆酸钠129mg),4-氨基安替 比林16mg,苯酚132mg,TritionX-100 0.2ml
• 酶试剂应用液：临用前取商品三酶（胆固 醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶）合 剂1ml,加基础液30ml,混匀既得
• 胆固醇标准液（5.17mmol/L）:精准称取胆 固醇200mg,用纯无水乙醇溶解，用乙醇定 容至100ml，分装4ºC保存，临用时取出
注意事项
• 1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致； • 2、比色应在30min内完成； • 3、试管在操作前尽量保持干燥； • 4、试剂中酶的质量影响测定结果 ； • 5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成
分中去掉胆固醇酯酶即可。
• 此法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰；胆 红素高于0.1g/L时有明显负干扰；血中维生 素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使 结果降低。高TG血症对本法无明显影响。 检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃ 可稳定1周，－20℃可稳定半年以上。
血清总胆固醇的测定实验报告
血清总胆固醇的测定实验报告实验报告
实验目的：
测定血清总胆固醇的浓度。
实验原理：
血清总胆固醇（total cholesterol, TC）可被酶促反应分析法（enzymatic reaction method）测定。
在反应液中加入胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，使血清中的TC被水解成自由胆固醇和酯化胆固醇，同时释放出的氢过氧化物（H2O2）与4-氨基安替比林（4-AAP）和3,5-二溴-4-硝基苯磺酸（DHNS）在高温下作用形成紫色化合物，其吸光度与TC的浓度成正比。
实验原料：
1. TC标准品（10.0 mmol/L）
2. 4-AAP（0.5 mmol/L）
3. DHNS（0.65 mmol/L）
4. 胆固醇酯酶
5. 胆固醇氧化酶
6. 磷酸盐缓冲液（pH
7.4）
实验步骤：
1. 取血清标本1.0 mL，并用离心机离心10分钟，除去沉淀后得到澄清的血清。
2. 取1.0 mL澄清的血清加入10 μL胆固醇酯酶，放置于37℃恒温槽中加水浴反应30分钟。
3. 倒入10 μL胆固醇氧化酶，再加入2.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4），混匀。
4. 加入15 μL4-AAP和15 μLDHNS，混匀后在37℃恒温槽中加水浴反应10分钟。
5. 记录吸光度（A）值，以TC标准品作为对照，计算出血清中TC的浓度。
实验结果：
本实验测定血清总胆固醇的浓度为X mmol/L。
实验结论：
采用酶促反应分析法测定血清总胆固醇的浓度，结果可靠，该方法操作简便，对临床诊断有参考意义。
总胆固醇检测试剂盒(COD-PAP 双试剂比色法)说明书
主波长/次波长 反应类型 反应方向
500/600nm 终点法
升反应(+)
计算公式：
血清、血浆等液体样本(空白调零)： FC(mmol/L)=A 测定/A 标准×5
血清、血浆等液体样本(全自动生化分析仪)：
FC(mmol/L)=(A 测定-A 空白)/(A 标准-A 空白)×5 组织样本(空白调零)：
V1=细胞样本取样量（ml）
V2=样本匀浆液总体积（ml）
参考区间： 健康成年人理想范围：<5.2mmol/L(<200mg/dl)
边缘升高：<5.23~5.69mmol/L(201~219mg/dl)
升高：≥5.72mmol/L(≥220mg/dl)
备注：TC 标准(5mmol/L)=442.48mg/dl
产品组成：
名称
规格
保存条件
总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP 双试剂比色法)
100T
4℃
试剂(A):
Good'sBuffer
Good's 溶液
显色剂
2×25ml
4℃
活性剂、稳定剂
试剂(B):
胆固醇氧化酶
COD-POD 溶液 4-氨基安替比林
2×25ml
-20℃避光
CEH、POD
临用前，按 A：B=1：1 混合，即为 COD-PAP 工作液，4℃保存。
FC(mmol/g)=A 测定/A 标准×5×V2/(m×1000) 组织样本(全自动生化分析仪)：
FC(mmol/g)=(A 测定-A 空白)/(A 标准-A 空白)×5×V/(m×1000) 细胞样本(空白调零)：
FC(mmol/L)=A 测定/A 标准×5×V2/V1
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
实验六 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇【原理】血清中总胆固醇(total cholesterol ，TC)包括游离胆固醇(free cholesterol ，FC)和胆固醇酯(cholesterol ester ，CE)两部分。
血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA)，胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢，H 2O 2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC 含量成正比。
【试剂】1．胆固醇液体酶试剂组成(具体含量见相关文献) GOOD's 缓冲液(pH6.7) 50mmol/L 胆固醇酯酶 ≥200U/L 胆固醇氧化酶 ≥100U/L 过氧化物酶 ≥3 000U/L 4-AAP 0.3mmol/L 苯酚 5mmol/L2．胆固醇标准溶液5.17 mmol/L (200 mg/dl) 精确称取胆固醇200 mg ，用异丙醇配成100 ml 溶液，分装后，4℃保存，临用取出。
也可用定值的参考血清作标准。
【操作步骤】 终点法检测TC 按下表依次加样。
酶法测定TC 操作步骤项目 测定管 标准管 空白管 血清(μl) 50 － － 标准液或定值血清(μl) －50－蒸馏水(μl) － － 50 酶试剂(μl)1.501.501.50混匀后，37℃保温5 min ，用分光光度计比色，于500 nm 波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
【计算】血清TC (mmol/L)＝标准管吸光度测定管吸光度×胆固醇标准液浓度【参考范围】血清参考值：3.0～5.20 mmol/L；危险阈值：5.20～6.20 mmol/L；高胆固醇血症：≥6.20 mmol/L。
【临床意义】1．TC增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症(如家族性高胆固醇血症、家族性ApoB缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等)、糖尿病、肾病综合征、总胆管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。
生化检验操作规程
生化检验操作规程(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--生化检验操作规程一. 血脂血糖1.胆固醇(1）方法学：胆固醇氧化酶法(2）实验仪器：上海科华卓越330全自动生化分析仪(3) 试剂成分：R1-胆固醇酯酶,抗坏血酸氧化酶，过氧化物酶，ESPAS，R2-胆固醇氧化酶，4-氨基安替比林(4)操作流程：开机->进入主程序->开始->杯空白测定->正常->将待测管放入样品盘检测孔中（如1孔）->进入样品界面->在界面左侧输入相应起始样品号（如1号）以及相应起始杯号（如1杯）->在右侧检测项目界面中选择“胆固醇”->点击下方申请测试->开始测试->加样针吸取样品管内血清3μL于比色盘的1号比色杯中->试剂针吸取胆固醇 R1试剂250μL于1号比色杯中->搅拌器搅拌混匀->37℃恒温5分钟->试剂针再吸取胆固醇 R2试剂125μL于1号比色杯中->搅拌器再次搅拌混匀->37℃恒温5分钟后比色测定->结果数据传至主程序开始菜单内的报告列表界面->检测完毕->在报告列表输入检验报告单相关信息->点击右下方打印报告->签字审核后发单。
(5）注意事项：①保证比色盘与试剂盘的洁净，定期检查。
每日检查试剂剩余量，及时补足。
②注意主程序界面内的试剂盘的温度变化，一旦持续增高，则考虑冷冻剂问题，予以更换。
③保证样品的良好待检状态，样本为血清，肝素或EDTA抗凝血浆，若当时不能检测则可2℃～8℃冷藏保存。
过度溶血的宜重新取血，若无法重新取血的应在检验报告单上注明，脂血的样本也应在检验报告单上标注，并且稀释后再行检测，黄疸的应先做空白对照，再行检测并将结果减去空白对照后再行出单。
④每日跟随样品进行质控检测绘出质控图，观察质控值是否在2SD以内，3SD为失控限，以便据此观察机器与试剂的状态是否在控。
常用生化检测项目分析方法与参数设置
常用生化检测项目分析方法及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。
因此必须理解各参数的确切意义。
一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
血胆固醇实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过血液检测，了解受试者的血胆固醇水平，分析其胆固醇组成，并探讨血胆固醇水平与个体健康状况之间的关系。
二、实验原理胆固醇是人体内一种重要的脂质，分为高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）两种。
HDL-C被称作“好胆固醇”，对心血管有保护作用；而LDL-C被称作“坏胆固醇”，长期偏高会增加心血管疾病的风险。
本次实验采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定受试者的血胆固醇水平。
三、实验材料1. 试剂：胆固醇测定试剂盒（ELISA法）、标准品、酶联反应板、洗涤液、底物、终止液、显色剂等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、微量加样器、振荡器等。
3. 样品：受试者空腹静脉血。
四、实验方法1. 样品处理：将受试者空腹静脉血采集后，按照试剂盒说明书要求，分离血清。
2. 标准曲线绘制：将标准品按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定吸光度（OD值），以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：将受试者血清按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定OD值。
4. 结果计算：根据标准曲线，计算受试者的血胆固醇水平。
五、实验结果1. 标准曲线：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：Y=0.065X-0.013，相关系数R²=0.998。
2. 受试者血胆固醇水平：受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，其中HDL-C为1.5mmol/L，LDL-C为3.7mmol/L；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，其中HDL-C为1.8mmol/L，LDL-C为5.0mmol/L。
六、分析与讨论1. 实验结果显示，受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，属于正常范围；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，属于偏高范围。
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇（标准管法）实验目的：1.了解自动生化分析仪的工作原理2.熟悉血清总胆固醇相关生化的检测项目及检测方法3.掌握血清总胆固醇相关生化检测项目的临床意义。
实验原理：胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇:血清中的胆固醇由游离胆固醇及胆固醇酯构成，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下水解为胆固醇，再与胆固醇氧化酶作用产生△4-胆甾烯酮及H202;后者在过氧化物酶的作用下，与苯酚及4-氨基安替比林作用生成红色化合物醌亚胺。
测定该红色化合物在500nm波长的吸光度，可以计算出血清总胆固醇含量。
实验操作：1.将准备好的酶工作液（胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、苯酚、4-氨基安替比林）加入空白管、浓度标准管、测定管各1.5ml，再向标准管加20μl胆固醇标准液（5.18mmol/L），再向测定管加入20μl血清。
2.将三支试管放入水浴锅中，37℃保温20分钟3.调节分光光度计波长500nm,透光度T至100%，将空白管试液对光的吸收调节为0，再用空白管调“零”点测定其他各管的吸光度。
实验结果:分光光度计测得标准管吸光度和测定管吸光度，根据朗伯-比尔定律,得到血清样品总胆固醇值=（测定管吸光度/标准管吸光度）x5.18分析讨论：为什么用酶酚混合液作为空白管溶液？酶酚混合液作为空白试剂，调节分光光度计透光度T至100%，可将酶酚混合液对光的吸收调节为0，从而消除对葡萄糖反应产物吸光度测定的影响。
思考题：1.血清甘油三酯升高有和临床意义？血脂代谢紊乱对机体有何危害？血清甘油三酯升高可能代表着各种疾病的发生：如原发性继发性高脂蛋白血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病、脂肪肝等。
血脂代谢紊乱对机体的危害：血脂代谢紊乱的影响分两种：1）高胆固醇血症引起的危害：主要是动脉粥样硬化，包括大动脉、中动脉、小动脉动脉硬化。
动脉斑块形成主要表现在心、脑、肾等位置，如果动脉硬化斑块较重或者不稳定，发生在心脏可出现急性心肌梗死；在脑血管会出现急性脑血栓，即急性脑梗死，以及肾脏出现急性肾梗死；在外周血管，如腿部可引起坏疽；2）高甘油三酯血症引起的危害：在暴饮暴食的情况下，高甘油三酯可以诱发急性胰腺炎。
游离胆固醇测定试剂盒(胆固醇氧化酶法)产品技术要求迪迈
游离胆固醇测定试剂盒（胆固醇氧化酶法）适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中游离胆固醇的浓度。
1.1 包装规格试剂：1×20mL试剂：1×24mL试剂：1×40mL试剂：1×80mL试剂：2×60mL试剂：3×40mL试剂：4×80mL试剂：5×60mL试剂：2×100mL1.2 主要组成成分MOPS缓冲液（pH7.0）：50 mmol/L4氨基安替比林（4AAP）：0.35mmol/L胆固醇氧化酶（CO）：0.3KU/L过氧化物酶（POD）：3KU/L苯酚：5mmol/L2.1 外观试剂为无色至浅红色澄清液体，无杂质、无絮状物。
2.2 净含量试剂净含量不少于标称装量。
2.3 试剂空白吸光度用纯化水作为样本加入试剂测试时，试剂空白吸光度应＜0.800。
2.4 分析灵敏度FCHO含量为1.5mmol/L时，测定吸光度差值的绝对值（△A）≥0.0100。
2.5 线性区间试剂线性在[0.2，10]mmol/L区间内；2.5.1 线性相关系数（r）应＞0.990；2.5.2 [0.2，2]mmol/L区间内，绝对偏差应在±0.2mmol/L；(2，10]mmol/L区间内，相对偏差应不超过±10%。
2.6 精密度2.6.1重复性重复测定高、中、低三个水平样本，结果的变异系数（CV）<10％。
2.6.2 批间差测定中水平浓度样本，试剂盒的批间相对极差（R）<10％。
2.7 准确度用国家标准物质（编号：GBW09203）进行测试，实测值与标示值的相对偏差在±15.0%内。
2.8 稳定性2℃～8℃避光保存，有效期为18个月。
试剂盒至有效期后2个月内，试剂性能应符合2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7的要求。
临床生化检验：5-血清甘油三酯和总胆固醇的测定
生活小知识
• 将每100克食物中胆固醇含 量为100～200毫克的食物称为 中度胆固醇食物
如草鱼、鲫鱼、鲢鱼、黄 鳝、河鳗、甲鱼、蟹肉、猪排、 鸡肉等；
生活小知识
将每100克食物中胆固醇含 量为200～300毫克的食物称高 胆固醇食物
如猪肾、猪肝、猪肚、蚌 肉、蛀肉、蛋黄、蟹黄等。
吃什么可以降低胆固醇？
血清甘油三酯和总胆固醇的测定
实验目的
• 1.掌握甘油磷酸氧化酶法测定血清甘油三酯 和胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇的基本 原理。
• 2.熟悉甘油磷酸氧化酶法测定血清甘油三酯 和胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇操作方 法。
• 3.了解血清甘油三酯和总胆固醇 测定的临床意义。
实验原理
甘油三酯+H2O CEH 甘油+脂肪酸 甘油+ATP 甘油激酶 甘油-3-磷酸+ADP
生活小知识
• 人体中的脂类大部分从食物中 来，所以甘油三酯高的人饮食 应有节制，主食之中应搭配部 分粗粮，副食品以鱼类、瘦肉、 豆及豆制品、各种新鲜蔬菜、 水果为主。
生活小知识
• 有助降甘油三酯的食物，如： 沙丁鱼、大马哈鱼、甜杏仁、 马齿苋，还有豆类，大蒜等。
• 还有一些利于降低血脂防治动 脉硬化的食物：海带、紫菜、 木耳、金针菇、香菇、洋葱等 可常吃。
生活小知识
• 饮牛奶宜去奶油，不加糖。蛋 类原则上每日不超过1个，烹 调食物用素油，少吃油煎食物。 少吃花生，因其中含油甚多， 但可以食用核桃肉、瓜子仁、 果仁等。
生活小知识
• 将每100克食物中胆固醇 含量低于100毫克的食物 称为低胆固醇食物
如鳗鱼、娼鱼、鲤鱼、 猪瘦肉、牛瘦肉、羊瘦肉、 鸭肉等；
甘油-3-磷酸+O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟酮+H2O2 H2O2+酚+4-氨基安替吡啉 POD 红色醌亚胺+H2O
TC文档,总胆固醇氧化酶法测定试剂盒(TC)检测标准操作规程
1、方法依据：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司总胆固醇(TC)测定试剂盒（氧化酶法）测定方法2、适用范围：适用于人血清总胆固醇(TC)的测定。
3、试剂仪器：3.1 试剂：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司原装试剂盒。
3.2未开启的试剂盒避光保存于2℃～8℃有效期为一年。
试剂开瓶后应避光保存，在2℃～8℃可稳定28天。
试剂不可冰冻。
3.3 仪器：迈瑞BS-2000M 全自动生化分析仪.4、操作程序4.1方法原理在胆固醇酯酶（CHE ）和胆固醇氧化酶（CHO ）的作用下，酯型胆固醇被催化产生过氧化氢（H 2O 2）。
过氧化氢在过氧化物酶（POD ）的作用下，与4-氨基安替比林（4-APP ）和酚缩合，生成醌系色素，通过测定此反应的吸光度可求得胆固醇的含量。
胆固醇酯 + H 2O胆固醇 + 脂肪酸胆固醇 + O 2 Δ4-胆甾烯酮 + H 2O 22H 2O 2 + 4-氨基安替比林+ 酚醌亚胺 + 4H 2O4.2样本要求 新鲜血清样本，采集后及时测定，应避免溶血和污染。
4.3上机操作4.3.1试剂装载、校准、样品和质控血清分析操作详见“《迈瑞BS-2000M 全自动生化分析PODCHE CHO仪标准操作、维护、保养规程》”。
4.3.2 校准：4.3.2.1 标准液的准备：校准品使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司配套冻干品，按说明书要求稀释后分装，-20℃冷冻保存，用前提前15分钟从冰箱中取出，复溶到室温后上机检测。
4.3.2.2 校准程序：首次使用校准。
当有以下情况时需重新校准：1）换试剂批号或出现质控漂移时；2）当仪器做完保养后；3）仪器进行零件更换时。
每次试验前用准备好的校准品进行校准，校准通过后进行检测。
4.3.2.3 质控：在标本开始之前做质控，质控通过后方能进行标本的检测。
4.3.3 测试基本参数4.4参考范围合适范围：≤ 5.17 mmol/L高度危险临界值： 5.6～6.6 mmol/L高度危险范围： > 6.6 mmol/L（注：各实验室应有自己的参考范围。
生化
GLU测定实验方法：酶法1葡萄糖氧化酶法（GOD）实验原理：葡萄糖氧化酶GOD能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2,生成的H2O2参与Trinder反应，生成醌亚胺色素，在505nm 波长下比色检测，生成的吸光度与葡萄糖浓度成正比。
反应式：葡萄糖+O2 GOD 葡萄糖酸+H2O2H2O2+4-氨基安替比林+酚POD 醌亚胺类+4H2O（无色）（红色）GOD仅高特异的催化β-D-葡萄糖，而葡萄糖中α型约占36%，因此葡萄糖的完全氧化需要α型变旋为β型。
现在的试剂大多含有变旋酶，延长孵育时间也可以达到自发变旋。
GOD-POD法还可测定脑脊液葡萄糖，但不能测定尿液葡萄糖，这是因为尿液中还原性干扰物质浓度过高而影响结果的真实性。
2己糖激酶法（HK）Glu + ATP HK Glu-6-P +ADPGlu-6-P +NADP+ G-6-PD 6-磷酸葡萄糖内酯+NADPH NADPH在340nm处有吸收峰，其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正比。
HK法的特异性比葡萄糖氧化酶高，是目前公认的测定血糖的方法，适用于自动化分析仪。
轻度溶血、脂血、黄疸、维生素C、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等不干扰标本测定。
溶血标本若血红蛋白超过5g/L时，因为从红细胞释放的有机磷酸酯和一些酶能消耗NADP。
无机化学法Folin-Wu法，基于葡萄糖醛基的还原性。
Cu2+ +Glu OH- Cu+ 磷钼酸显色特异性差有机化学法：邻甲苯胺+Glu 缩合葡萄糖基胺脱水希夫式碱分子重排蓝灰色化合物干扰因素多参考范围：空腹血糖<6.1mmol/L 服糖后30~60min血糖升高达峰值，一般<10mmol/L 服糖2小时恢复至空腹血糖水平临床意义1．糖是人体的主要能量来源，也是构成机体结构物质的重要组成成分。
血糖浓度受神经系统和激素的调节而保持相对稳定，当这些调节失去原有的相对平衡时，则会出现高血糖或低血糖。
临床检测血糖浓度主要用于糖尿病的诊断。
血清总胆固醇(TC)测定操作规程
血清总胆固醇(TC)测定操作规程A1．2 原理血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Chol)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trinder反应)。
醌亚胺的最大吸收在500nm 左右，吸光度与标本中总胆固醇呈正比。
反应式如下：胆固醇酯+H2O CEH 胆固醇+游离脂肪酸胆固醇+02 CHOD △4-胆甾烯酮十H2022H202+4－氨基安替比林+酚POD 昆亚胺+4H2OA1．3．1 受检者(体检对象或病人)的准备：除总胆固醇不一定用空腹血外，测定甘油三酯、脂蛋白与载脂蛋白的病人必须空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，近期内体重稳定，无急性病、外伤、手术等意外情况。
妊娠后期各项血脂都会增高，应在产后或终止哺乳后3个月检验才能反映其基本血脂水平。
注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药、噻嗪类利尿剂、β受体阻滞剂、免疫抑制剂、某些降压剂、降糖药、胰岛素及其他激素制剂等，检验以前应根据所用药物的特性停止用药数天或数周，否则应记录用药情况。
对体检对象及做前瞻性观察者，还应注意采血的季节，因为血脂水平有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。
应嘱体检对象在抽血前24h内不作剧烈运动。
A1．3．2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，因此影响血脂水平。
例如站立5 min 可使血脂浓度提高5％，15 min提高16％，故在采血前至少应***5min。
一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1 min，穿刺成功后立即松开止血带。
静脉阻滞5min可使甘油三酯增高10％～15％。
A1. 3．3 抗凝剂：我国多用血清作血脂检验。
如用血浆，多主张用EDTANa2(1mg／mL)抗凝。
【检验医学】胆固醇氧化酶法测定
3小时。不能立刻测定的标本要分离血清，转 移至有盖子的小试管中，当天不能测定的，可 暂时存放于4℃冰箱保存。
方法学评价
• 本方法灵敏度高，准确度高，精密度好，线性 范围宽
• 对标准参考物的要求较高（要求有定值的校准 液），且容易受到一些还原物质如尿酸、胆红 素、维生素C、谷胱甘肽等的干扰
• 本实验检测/可报告范围0.08～20.7 mmol/L， 分析灵敏度（检测低限）0.08 mmol/L
胆固醇氧化酶法测定 血清总胆固醇
目的
• 掌握酶法测定血清胆固醇的基本 原理及操作
• 熟悉血清胆固醇测定的临床意义 • 了解酶法测定血清胆固醇的特点
和注意事项
简介
• 决定方法为同位素稀释—质谱法 • 参考方法为正己烷抽提L-B反应
显色法（AL-BK法） • 常规方法为酶法（胆固醇氧化酶
法（COD-PAP））
试剂与器材
• 缓冲液 • 色原 • 4-AAP • 胆固醇酯酶 • 胆固醇氧化酶 • 过氧化物酶 • 全自动生化分析仪；半自动生化分析仪
原理
• 胆固醇酯＋H2O 胆固醇酯酶 胆固醇＋RCOOH
• 胆固醇＋O2 胆固醇氧化酶 Δ4—胆甾烯酮＋H2O2
• 2 H2O2 ＋4－氨基安替比林 + 酚 过氧化物酶 醌亚胺＋4 H2O
• TC降低：常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、 甲状腺功能亢进、肝疾病、严重感染、营养不 良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性 黄疸及慢性消耗性疾病，如晚期癌症等。
注意事项
• 血清和血浆（肝素、EDTA-K2、EDTA-NA2）均 可供TC测定，但后者结果比前者结果低3%。不 可使用柠檬酸、草酸或氟化物抗凝。
胆固醇氧化酶的三相分离及 其血清总胆固醇的测定
第39卷第2期西南师范大学学报(自然科学版)2014年2月V o l.39N o.2 J o u r n a l o f S o u t h w e s t C h i n aN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)F e b.2014文章编号:10005471(2014)2000109胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定①王琼,霍影,汪静,张清燕,任尧,葛方兰四川师范大学生命科学学院,成都610101摘要:对一株胞外胆固醇氧化酶高产菌C O X48进行了三相分离,结果表明:最优分离条件为:硫酸铵异丙醇沉淀,硫酸铵饱和度为70%,异丙醇与发酵上清液的体积比为0.8ʒ1时,p H值为9,在20ħ下静置30m i n,12000 r/m i n离心10m i n,纯化倍数4.5倍,回收率高达95%.酶动力学方法检测胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量,其线性回归方程为y=0.0064x+0.0027,R2=0.9654,线性范围0~7.16mm o l/L.结果表明了该酶具有作为临床诊断试剂的潜力,并为临床上利用酶动力学方法测定血清总胆固醇含量奠定了实验基础.关键词:胆固醇氧化酶;三相分离;酶动力学方法中图分类号:Q814文献标志码:A胆固醇是脊椎动物细胞膜的重要组成成分,它具有多种多样的生理功能.但是体内过多的胆固醇却是引起冠心病㊁动脉硬化和心肌梗塞的危险因素之一.目前欧美等发达国家冠心病的死亡率已经超过所有癌症死亡率的总和,占总死亡率的27.4%[1].胆固醇氧化酶(C O D)能够催化胆固醇氧化成为胆甾4烯3酮.因此可以用它来检测血液中胆固醇的含量.它可以分解食物中的胆固醇,已经应用在心血管疾病的治疗当中[2-4].另外,它还能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是一种生物杀虫剂[5].它的氧化产物还具有抗肥胖㊁治疗肝病等疗效[6].三相分离技术(T P P)是将硫酸铵与有机溶剂混合后形成有机相㊁中间沉淀相和水相的原理而用于分离蛋白质的技术.常用于三相分离的有机溶剂有乙醇㊁丙酮㊁异丙醇㊁甲醇等,有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右,使用不同的酶和不同的有机溶剂时,有机溶剂的使用浓度都有所不同,同时该技术还受温度和p H的影响[7].本研究采用了实验室保存菌中筛选得到1株胞外胆固醇氧化酶高产菌C O X48,三相分离用于纯化胆固醇氧化酶的最合适的体系是当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1,硫酸铵饱和度为70%;最适提取温度和时间分别为20ħ,30m i n,最适p H值为9.0,并采用酶动力学方法检测胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量,对其准确性进行了分析.其线性回归方程为y=0.0064x+0.0027,R2=0.9654,线性范围0~7.16mm o l/L.结果表明了该酶具有作为临床诊断试剂的潜力,并为临床上利用酶动力学方法测定血清①收稿日期:20130530基金项目:四川师范大学校级重点资助项目(11K Y L05).作者简介:王琼(1980),女,四川宣汉人,硕士,实验师,主要从事分子微生物学的研究工作.通信作者:葛方兰,硕士,副教授.2西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷总胆固醇含量奠定了实验基础.1材料与方法1.1胆固醇氧化酶的来源四川师范大学分子生物与微生物研究室保存产胆甾4烯3酮的菌株C O X48(R h o d o c o c c u s e s p.)发酵所产的胆固醇氧化酶的粗酶液.1.2主要药品胆固醇(国药)㊁辣根过氧化物酶(国药)㊁T r i t o n X100(进口分装)㊁胆固醇氧化酶(S I GMA)㊁4氨基氨替比林(国药)㊁胆固醇酯酶(实验室保存)㊁测定血清总胆固醇含量的试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)㊁人血清标本(四川省第二中医医院).酵母粉㊁大豆蛋白胨(O X O I D)㊁硫酸铵㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇㊁丙酮(均为国产药品).1.3酶活力测定的试剂和工作液1.3.1100ˑ4氨基氨替比林(4A A)溶液称取2.0324g4氨基氨替比林溶于超纯水中,最后定容至100m L,用棕色瓶装,4ħ避光保存.1.3.2100ˑ叠氮钠溶液称取2g叠氮钠溶于超纯水中定容至100m L,用棕色瓶装,4ħ避光保存.1.3.3 A液分别加入1m l100ˑ4A A溶液(终浓度为1mm o l/L),1m L100ˑ叠氮钠溶液(终浓度为0.2g/L), 56μL重蒸酚(终浓度为6mm o l/L),700U辣根过氧化物酶(终浓度为7000U/L),用25mm o l/L㊁p H7.5的磷酸钾缓冲液定容至100m L.1.3.4胆固醇底物溶液(B液)胆固醇需先用碾钵碾细(便于溶解),称取0.1652g胆固醇溶于异丙醇中,同时加入T r i t o n X100(最终体积分数为4.26%)助溶,然后用异丙醇定容至20m L,4ħ密封保存.1.4制作胆固醇标准曲线试剂配制1.4.1 C液[8]4氨基安替比林:0.5mm o l/L;重蒸酚:20mm o l/L;胆酸钠:0.5mm o l/L;辣根过氧化物酶: 10000U/L;磷酸钾缓冲液:0.1m o l/L,p H7.0;T r i t o n X100:9g/L;不同酶活单位的胆固醇氧化酶.1.4.2 D液[8]将一系列不同底物浓度(0~25.6mm o l/L)的底物胆固醇溶于乙醇中,其中加入T r i t o n X100助溶(最终体积分数为20%).2方法2.1胆固醇氧化酶活力测定操作方法[9]:在小试管中取3m LA液与150μLB液混合,37ħ下在恒温水浴锅中保温3m i n,加入50μL粗酶液,迅速混匀,37ħ准确反应5m i n,立即沸水浴3m i n,将试管放于冰水中冷却澄清,于500 n m下测定吸光度.酶活(U/m L)为1.6832ˑA500.2.2酶的分离纯化2.2.1不同硫酸铵饱和度对酶初步纯化收率的影响在粗酶液中加入不同饱和度的硫酸铵(40%~90%),5ħ下静置2h,12000r/m i n,冷冻离心10m i n,收集沉淀,用p H7.5的10mm o l/L的磷酸缓冲液溶解后按照胆固醇氧化酶的测定方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.2 不同有机溶剂对酶初步纯化收率的影响在粗酶液中加入不同体积的有机溶剂(正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇㊁丙酮),5ħ下静置2h ,12000r /m i n 冷冻离心10m i n ,收集沉淀,用p H 7.5的10mm o l /L 的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.3 不同有机溶剂对酶三相分离收率的影响5ħ条件下,在粗酶液中加入饱和度为70%的硫酸铵,待溶解后,将不同体积的不同有机溶液加入,5ħ下静置2h 分为3层,12000r /m i n 冷冻离心10m i n ,收集中间的蛋白相,用p H 7.5的10mm o l /L 的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.2.2.4 温度和时间对酶三相分离的影响用2.2.2的结果,改变三相分离体系的抽提温度(5,10,20,25,30,40ħ)和时间(10,20,30,60,90,120m i n ),以上述相同方法收集中间蛋白相测定胆固醇氧化酶的酶活和蛋白质浓度.2.2.5 不同p H 对酶三相分离的影响根据2.2.2和2.2.3的实验结果,对三相分离体系的p H 环境进行优化,改变上清液的p H (4~11),以上述相同方法收集中间蛋白相并测定胆固醇氧化酶的酶活和蛋白质浓度.2.3 血样的采集与处理样本来源:四川省第二中医医院采集胆固醇浓度从高到低的8个血清标本.样本处理:采用静脉采样,同时加入E D T A -N a 2(1m g /m L )的抗凝剂,尽快送实验室,室温放置30~40m i n 后,用冷冻离心,得到血清置于洁净的试管中加盖保存.血清标本在室温中放置不超过3h ,4ħ保存可稳定4d .置-70ħ可长期保存,但不可反复冻融.总胆固醇含量的测定:采用测定血清总胆固醇含量的试剂盒,按照试剂盒测定血清总胆固醇含量的方法(终点法),测定血清标本胆固醇的准确浓度.2.4 动力学方法和终点法测定胆固醇含量2.4.1 终点法直接加入C 液保存3m i n 后,和D 液准确反应10m i n ,然后沸水浴3m i n 终止反应,待澄清后于500n m 下测定吸光度.2.4.2 酶动力学方法直接加入C 液保存3m i n 后,每隔5s 检测一次酶活,最后测出每分钟吸光值的变化.2.5 酶动力学方法的优化2.5.1 酶动力学方法反应体系中胆固醇与反应试剂的比例研究研究发现,在酶动力学反应中,底物在反应体系中的浓度直接影响着胆固醇氧化酶测定胆固醇的准确性,因此在测定血清总胆固醇之前,对反应体系中底物浓度的优化很重要.选取了底物ʒ反应试剂浓度梯度为1ʒ100,1ʒ20,1ʒ10进行比较研究.2.5.2 酶动力学方法中不同的胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响不同的胆固醇氧化酶酶活,在用于测定胆固醇含量时,其准确度也不一样.实验通过比较100U /L ,200U /L ,400U /L ,800U /L 这4个不同的酶活单位,确定一个最佳的测定胆固醇含量的酶活,为酶动力学方法的构建打好基础.2.6 动力学方法测定血清总胆固醇含量的准确度研究2.6.1 胆固醇氧化酶的血清总胆固醇含量标准曲线用制作胆固醇含量标准曲线的动力学方法,以已知总胆固醇含量的血清为底物(浓度0~7.16mm o l/L ),制作该胆固醇氧化酶的血清总胆固醇含量标准曲线,确定该酶采用动力学方法在检测血清总胆固醇含量的准确性.3第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定2.6.2酶动力学反应进程的测定选取2.561mm o l/L和5.2mm o l/L两个总胆固醇浓度的血清样本为底物,测定反应30,60,120,180, 210,240s的吸光值变化.2.7胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量的精密度的研究方法选取低㊁中㊁高3个总胆固醇浓度的血清样本(2.561,3.953,5.2mm o l/L),1d内分别做6个重复测定该样本的总胆固醇含量,确定该酶的日内精密度;同时连续做6d,每天测定一次该样本的总胆固醇含量,确定该酶的日间精密度;最后对血清总胆固醇含量回收率进行检测,在3个血清样本中加入相同浓度的相同体积的血清,并混合,然后用上述同样的方法检测该样本中胆固醇的含量,最后计算出该胆固醇氧化酶在用于测定血清总胆固醇含量的回收率.3结果3.1不同硫酸铵饱和度对酶初步纯化收率的影响由图1可知,硫酸铵饱和度从40%提高到70%时,回收率和比酶活都大体成上升的趋势;当硫酸铵的饱和度为70%时,沉淀的目的酶蛋白达到最多,回收率达48%,比酶活达1U/m g,发酵上清液的比酶活为0.39U/m g,纯化倍数为2.5倍;随后,开始呈下降的趋势.通过对硫酸铵饱和度的优化,确定其最优的沉淀条件,为后面对三相分离的研究提供了条件.3.2不同有机溶剂对酶初步纯化收率的影响利用丙酮㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇等5种有机溶剂分别纯化胆固醇氧化酶,并对其酶的收率进行检测,结果如下:丙酮沉淀胆固醇氧化酶的结果如图2所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的丙酮沉淀条件是:当V(丙酮)ʒV(发酵上清液)为0.4ʒ1时,酶回收率达到7.27%,比酶活为0.13U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为0.69倍.图1硫酸铵饱和度对C O D收率的影响图2丙酮沉淀对C O D收率的影响正丙醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图3所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和其比酶活可知,最优的正丙醇沉淀条件是:当V(正丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到2.79%,比酶活为0.11 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为0.6倍.异丙醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图4所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的异丙醇沉淀条件是:当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到2.99%,比酶活为0.23 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为1.21倍.正丁醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图5所示,综合考虑该胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丁醇沉淀条件是:当V(正丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到1.45%,比酶活为0.18 U/m g,发酵上清液的比酶活为0.18U/m g,纯化倍数为1倍.叔丁醇沉淀胆固醇氧化酶的结果如图6所示,综合考虑胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的叔丁醇沉淀条件是:当V(叔丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1时,酶回收率达到3.68%,比酶活为0.23 4西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.18U /m g,纯化倍数为1.2倍.图3 正丙醇沉淀对C O D 收率的影响图4 异丙醇沉淀对C O D 收率的影响图5 正丁醇沉淀对C O D 收率的影响图6 叔丁醇沉淀对C O D 收率的影响3.3 不同有机溶剂对酶三相分离收率的影响对比了丙酮硫酸铵㊁正丙醇硫酸铵㊁异丙醇硫酸铵㊁正丁醇硫酸铵㊁叔丁醇硫酸铵的三相分离对酶回收率的影响,其中使用的硫酸铵饱和度均为70%.希望通过对不同有机溶剂体积进行优化,获得适合用于胆固醇氧化酶纯化的三相分离体系.3.3.1 丙酮硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图7所示,综合分析胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的丙酮硫酸铵沉淀条件是:当V(丙酮)ʒV (发酵上清液)为0.5ʒ1时,酶回收率达到51.42%,比酶活为1.22U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.31U /m g,纯化倍数为3.1倍.3.3.2 正丙醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图8所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丙醇-硫酸铵沉淀条件是:当V (正丙醇)ʒV (发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到64.26%,比酶活为1.48U /m g ,发酵上清液的比酶活为0.31U /m g,纯化倍数为3.75倍.图7 不同体积的丙酮硫酸铵对C O D收率的影响图8 不同体积的正丙醇硫酸铵对C O D 收率的影响3.3.3 异丙醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图9所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的异丙醇硫酸铵沉淀条件是:当V (异5第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1时,酶回收率达到62.27%,比酶活为1.61U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为4.09倍.3.3.4正丁醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图10所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的正丁醇-硫酸铵沉淀条件是:当V (正丁醇)ʒV(发酵上清液)为0.9ʒ1时,酶回收率达到59.87%,比酶活为1.24U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为3.39倍.图9不同体积的异丙醇硫酸铵对C O D收率的影响图10不同体积的正丁醇硫酸铵对C O D收率的影响3.3.5叔丁醇硫酸铵沉淀胆固醇氧化酶与收率如图11所示,综合胆固醇氧化酶的回收率和比酶活可知,最优的叔丁醇硫酸铵沉淀条件是:当V(叔丁醇)ʒV(发酵上清液)为1ʒ1时,酶回收率达到54.18%,比酶活为1.13U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为2.88倍.通过对不同的有机溶剂的体积进行优化比较,得出三相分离用于纯化胆固醇氧化酶的最合适的体系是当V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1㊁硫酸铵饱和度为70%时,酶回收率达到62.27%,比酶活为1.61U/m g,发酵上清液的比酶活为0.31U/m g,纯化倍数为4.09倍.这比硫酸铵㊁有机溶剂单独用于沉淀纯化酶时,更有利于生产中胆固醇氧化酶的规模化分离纯化.3.4不同抽提温度和时间对酶三相分离收率的影响采用异丙醇-硫酸铵三相分离方法,以V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1㊁硫酸铵饱和度为70%为基础,对三相分离的提取温度和时间进行了优化,结果如图12,最适提取温度和时间分别为20ħ,30 m i n,回收率达81.49%,发酵上清液的比酶活为0.29U/m g,纯化倍数高达4.1倍.图11不同体积的叔丁醇硫酸铵对C O D 收率的影响图12温度和时间对C O D收率的影响3.5不同p H对酶三相分离收率的影响将溶有硫酸铵(饱和度为70%)的发酵上清液的p H从4.0调到11.0,按照上述的最优条件进行胆固醇氧化酶的三相分离纯化的优化,其结果如图13所示,p H从4.0到9.0,该酶的回收率和比酶活都逐渐增大,p H为9.0时,回收率和比酶活都达到最大值,分别为95%和1.87U/m g,纯化倍数高达4.5倍.通过6西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷对酶三相分离体系中的p H 条件进行优化,为胆固醇氧化酶的进一步分离纯化奠定了基础.3.6 用酶动力学方法和酶终点法测定胆固醇含量分别利用胆固醇氧化酶用酶终点法和酶动力学方法测定胆固醇含量,比较分析其准确性,结果如图14所示,从图中两条曲线的线性关系可知,酶动力学方法的曲线接近于直线,在临床上用于测定胆固醇方面准确性更高,具有较好的应用前景.图13 p H 对C O D比酶活的影响图14 终点法和动力学方法测定胆固醇含量的比较3.7 酶动力学方法的优化3.7.1 酶动力学方法反应体系中胆固醇与反应试剂的比例研究对酶动力学方法反应体系中胆固醇溶液与反应试剂体积比进行优化研究,其结果如图15所示.通过对4个不同体积比的线性关系分析可知,在V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100的条件下,其线性关系的准确度最高.3.7.2 酶动力学方法中不同的胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响对胆固醇氧化酶酶活对线性关系的影响进行了分析,由图16可知,最优的测定胆固醇标准曲线制作条件是:V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100,酶活单位为100U /L ,制作出标准曲线的公式为y =0.0011x +0.0011,变异系数R 2=0.9915,P <0.001.其符合生物统计学的要求.图15 反应体系中胆固醇含量的比例图16 不同的酶活对线性关系的影响3.8 用动力学方法测定血清总胆固醇含量的准确度研究3.8.1 胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇标准曲线的制作根据上述结果,用酶动力学方法,在V (底物)ʒV (反应试剂)为1ʒ100,酶活单位为100U /L 的条件下,制作了人体血清总胆固醇含量的标准曲线.通过试验可得,用该酶测定人体血清总胆固醇含量时,结果如图17,制作出标准曲线的公式为y =0.0064x +0.0027,变异系数R 2=0.9654.其准确度较高,测定血清总胆固醇含量的线性范围为0~7.16mm o l /L .3.8.2 酶动力学反应进程的测定测定血清总胆固醇含量的反应进程如图18所示,从反应开始到120s 为反应的延迟期,180s 到240s为该酶的反应初速度.由于该酶初速度的开始时间为反应进行180s 后,历经1m i n,时间较长,便于实验7第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定操作.图17测定血清总胆固醇标准曲线的制作图18反应速率的测定3.9胆固醇氧化酶测定血清总胆固醇含量的精密度研究用酶动力学方法测定血清总胆固醇含量的精密度,如表1所示,日内精密度的变异系数为3.79%;日间精密度的变异系数为4.37%.该酶用于测定血清总胆固醇含量的回收率高达90.9%,因此,该酶在测定血清总胆固醇含量准确度方面有很好的应用前景,通过该研究为临床上的研究提供了更有利的证据.表1C O D日内精密度、日间精密度和回收率的测定评价方法平均值/(mm o l㊃L-1)标准偏差/(mm o l㊃L-1)变异系数/%回收率/%日内精密度(n=6)低2.780.165.89中4.210.133.02高5.670.142.47平均数3.79日间精密度(n=6)低2.960.186.38中4.340.163.77高5.460.162.95平均数4.37回收率(混合)低+中(1+1)82.99低+高(1+1)96.50中+高(1+1)93.21平均数90.904讨论本研究选用丙酮㊁正丙醇㊁异丙醇㊁正丁醇㊁叔丁醇这5种有机溶剂作为三相分离的有机相,用三相分离从乳化发酵液中分离纯化胆固醇氧化酶,优化后的三相分离条件为:在20ħ下,调节发酵上清液的p H 至9.0,加入硫酸铵使其饱和度为70%,溶解后加入异丙醇,并且V(异丙醇)ʒV(发酵上清液)为0.8ʒ1,静置30m i n后分相,12000r/m i n离心10m i n,收集中间蛋白相,用p H7.5的10mm o l/L的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度.经三相分离纯化后,胆固醇氧化酶的纯化倍数为4.5倍,回收率达95%.结果表明,三相分离技术为胆固醇氧化酶的进一步纯化奠定了基础,同时也为规模化工业生产提供了一种简便而效率高的纯化方法.对该酶的临床应用研究表明,采用动力学方法用该酶测定血清总胆固醇含量,当底物的体积与反应体系的体积比为1ʒ100㊁酶的酶活为100U/L时,制作标准曲线,线性回归方程为y=0.0064x+0.0027, R2=0.9654.其准确度表现为较高,用于测定血清总胆固醇含量范围为0~7.16mm o l/L.同时对该酶测定血清总胆固醇含量的精密度进行了研究,通过做6个日内重复和6个日间重复,结果显示该酶的日内精密度的变异系数为3.79%,日间精密度的变异系数为4.37%.同时该酶用于测定血清总胆固醇含量的回收8西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第39卷率高达90.9%,该酶在测定血清总胆固醇含量准确度方面有很好的应用前景.参考文献:[1]牛天贵,吕 莹,蔡同一,等.降解食品中胆固醇的芽胞杆菌T 12_1的筛选与应用研究[J ].中国农业大学学报,2001,6(1):74-78.[2] 吕陈峰,陈毅力,王龙刚,等.胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾4烯3酮[J 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e da n dv o r t e x e d g e n t l y ,f o l l o w e db y a d d i t i o no f i s o p r o p a n o l (80%).T h em i x t u r e i s t h e n i nc u b a t ed a t 20ħf o r 30m i n f o r t he t h r e e -p h a s e f o r m a t i o n .T h e s e p h a s e s a r e t h e ns e p a r a t e db y c e n t r i f u g a t i o n a t 12000r /m i n f o r 10m i n .T h e r e s u l t s s h o wt h a t 95%r e c o v e r y o f a c t i v i -t y wi t h4.5f o l d p u r i f i c a t i o n f o r c h o l e s t e r o l o x i d a s eh a s b e e na c h i e v e d .K e y w o r d s :C h o l e s t e r o l o x i d a s e ;t h r e e -p h a s e p a r t i t i o n i n g ;t h e e n z y m a t i c k i n e t i cm e t h o d 责任编辑 周仁惠9第2期 王 琼,等:胆固醇氧化酶的三相分离及其血清总胆固醇的测定。
胆固醇氧化酶结构式
胆固醇氧化酶结构式
胆固醇氧化酶是一种生物酶，在胆固醇代谢过程中起着重要作用。
本文将介绍胆固醇氧化酶的活性位点、辅酶因子、结构域、分子结构和亚基组成等方面的内容。
1.活性位点
胆固醇氧化酶的活性位点是其与底物结合并催化反应的关键部位。
该酶的活性位点位于一个名为α-β-β-α四元结构的环上，该环由四个α螺旋组成。
在活性位点中，关键的氨基酸残基是组氨酸和丝氨酸，它们在催化过程中起到关键作用。
2.辅酶因子
胆固醇氧化酶是一种依赖于铜离子的酶。
在酶促反应中，铜离子起到关键的辅酶因子作用。
胆固醇氧化酶的辅酶因子是一个四价的铜离子，该离子位于活性位点的中心位置，与组氨酸和丝氨酸残基结合在一起。
3.结构域
胆固醇氧化酶的结构域分为两个主要部分：N端结构域和C端结构域。
N 端结构域负责与底物结合，而C端结构域则起到维持酶的稳定性和催化机制的作用。
4.分子结构
胆固醇氧化酶的分子结构是由多个亚基组成的四聚体。
每个亚基都包含一个N端结构域和一个C端结构域，这些亚基通过非共价相互作用形成四聚体。
四聚体的形成有助于提高酶的稳定性和催化效率。
5.亚基组成
胆固醇氧化酶的四聚体由四个亚基组成。
这些亚基的组成因物种和来源而异，但通常是由相同的多肽链组成。
这些亚基在分子结构上相似，每个亚基都包含一个N端结构域和一个C端结构域。
总结：
本文介绍了胆固醇氧化酶的结构式，包括活性位点、辅酶因子、结构域、分子结构和亚基组成等方面的内容。
这些信息有助于理解胆固醇氧化酶在胆固醇代谢过程中的作用机制和功能。
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胆固醇氧化酶法（Cholesterol oxidase）
血清中测定方法包括化学方法和酶法，化学方法包括抽提法和直接测定法
酶法临床上常用的是胆固醇氧化酶法
LDL是一组不均一的富含胆固醇的脂蛋白颗粒，颗粒大小、电荷或apoB含量等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL 组分中胆固醇含量。
由于化学沉淀法和免疫分离法测定LDL-C均需要进行样本预处理，其最大缺点是不能进行自动化分析，不适应大规模流行病学调查或临床大批量标本诸多项目同时检测。
国外近两年相继研制开发出几种不同类型的均相测定法，标本不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪自动测定。
(1)选择性反应法［12～14］：基于用表面活性剂控制酶与相应脂蛋白的反应的新技术研制而成，多为液体双试剂。
目前有两类检测系统：第一类系统的试剂1中的表面活性剂1可使血清样品中的HDL、CM和VLDL颗粒解离，Chol分子被开释出来，与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时LDL颗粒还是完整的。
加试剂2(含表面活性剂2和偶联剂DSBmT)，它可使LDL颗粒解离开释Chol，参与Trinder反应而显色，因其他脂蛋白的Chol分子已除往，光彩深浅与LDL-C量呈比例［12，13］。
HDL 目前临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法大致可分为3代。
第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为多阴离子,如磷钨酸(FTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇（PEG）与某些两价阳离子(如Mg2＋、Ca2＋、Mn2＋)适用。
最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法(HM法),后多采用DS50-Mg2＋矿法,欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法
(PTA-Mg2＋法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。
1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2＋法作为HDL-c测定的常规方法。
但此类方法常因含apoB的脂蛋白组份沉淀不完全导致结果假性偏高。
第2代采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法(美国Reference Diagnostics 公司试剂),省往了离心步骤,但需特殊装置,该剂不适于推广应用。
第3代为匀相测定法,轩d 本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在正确度和精密度方面基本达到NCEP 的分析目标,因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。
PEG修饰酶法(PEG-modified enzvme HDL-C assay,PEGME法)在Mg2+的存在下,α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。
这些复合物能抵抗变构酶的作用；PEG 6000或葡聚糖右旋糖苷与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶共价结合,引起酶的变构,变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性,其顺序依次为LDL。