实验十四血清胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)

实验十四血清胆固醇测定

（胆固醇氧化酶法）

胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定，后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便、结果准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方法。

【目的】

1．了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作。

2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。

【原理】

血清中总胆固醇（TC）包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC),酯型占70%，游离型占30%。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：

CEH

胆固醇酯胆固醇 ＋ 脂肪酸

胆固醇 ＋ O2△4-胆甾烯酮 ＋ H

O2

2

2H2O2 ＋ 4-氨基安替比林 ＋ 酚红色醌亚胺【器材】

试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。

【试剂】

酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。

1. 酶应用液胆固醇酶试剂的组成为：

磷酸盐缓冲液 50mmol/L

胆固醇酯酶≥200U/L

胆固醇氧化酶≥100U/L

过氧化物酶≥3 000U/L

4-氨基安替比林 mmol/L

苯酚 5 mmol/L

此外还含有胆酸钠和Triton X-100，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。

2． mmol/L（200mg /dl）胆固醇标准液

精确称取胆固醇 200mg溶于无水乙醇，移入100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制)。

【操作】

取试管3支，编号，按下操作。

表3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤

加入物（ml）测定管标准管空白管

血清－－胆固醇标准液－－

蒸馏水－－

酶应用液

混匀后，37℃水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

【计算】

血清胆固醇 (mmol/L) ＝ 测定管吸光度

标准管吸光度

× 5.17

【注意事项】

1. 黄疸血清过高的胆红素可还原—部分反应中的H2O2，降低显色反应，使结果偏低。但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。

2. 用胆固醇标准液引起的误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。

3. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加COD 的空白管从结果中减去后纠正。

4. 其它影响因素，如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。

【正常参考范围】

～L

【临床意义】

1. 血清胆固醇增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退。

2. 血清胆固醇降低常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。

【结果及分析】

【思考题】

1．胆固醇有哪些重要的生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么？

2．胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄？

3．实验中需要哪几种酶参加，各有什么作用？