ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案
染色质免疫共沉淀XChIP实验设计
染色质免疫共沉淀 X ChIP 实验设计ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。
染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。
这种方法具有空间性与时效性。
该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。
1交联和细胞收获。
甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。
交联结果的好坏决定于交联时间的把握。
-30分钟。
过度的交联会减少抗原的结合性和我们建议样品交联的时间一般为2超声断裂的效率。
抗原决定簇也会被掩盖。
加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。
1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿(1*107-5*107个细胞/皿)。
将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。
2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。
3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。
5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。
预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。
2。
超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。
不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。
交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。
样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。
片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。
如图一所示图一:2超声破碎后，8，000g，30秒，4?C,离心。
将上清移入新的管子中。
开始准备进行染色质免疫共沉淀(IP)。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）⼀. 实验前准备：1. 实验设计与分组2. 实验试剂、耗材、仪器准备3. 试剂盒：Pierce™ Agarose chip Kit⼆. 实验开展：(以哺乳动物贴壁细胞为例)A. 交联与细胞裂解1. ⽤15cm培养⽫培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107 个，待⽤。
以下步骤基于1次ChIP试验2. 交联：向每个含有培养液的培养⽫中，加⼊16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养⽫, 使混匀, 室温孵育10min. (交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产⽣假阳性)3. 终⽌交联：向上述培养⽫中，加⼊10X的⽢氨酸溶液使其终浓度为1X的。
混匀，室温孵育5min。
4. 吸出培养⽫中含有甲醛-⽢氨酸的混合培养基。
⽤1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。
5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。
然后将此混合液加⼊清洗后细胞中，再⽤细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液⽤移液器转移到1.5m的微管离⼼管中。
6. 将搜集的细胞于3000g离⼼5min。
除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进⾏⼀下步骤：酶解附：蛋⽩量检测：WBB. 酶解断裂染⾊质1. 准备好上述交联好的细胞。
如果是冻存的，需在冰上解冻。
2.加100ul含蛋⽩酶抑制剂的Lysis Buffer 1⾄细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离⼼管15s，置于冰上孵育10min;9000g离⼼3min，弃除上清。
3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/µL)，涡漩离⼼管，在37°⽔浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀;4. 加10µl的MNase stop 溶液终⽌反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。
5. 9000g离⼼5min，去上清，重新获得核酸复合物。
6. ⽤50µl的含(蛋⽩酶/磷酸蛋⽩酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。
染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案
染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案染色质免疫沉淀分析(ChIP) 是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的比较好的一种方法。
so，我们今天来聊聊染色质免疫沉淀分析方法。
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。
它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白质抗体（CHIP级别），免疫共沉淀结合蛋白的染色质片段；第三，分析目标DNA。
这里我们就要说到CHIP技术工具之——植物染色质免疫沉淀试剂盒了。
它的原理是什么呢？不妨以P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒来举个栗子~~P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合蛋白进行免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，用以确定结合蛋白的目标DNA。
接下来再说说它的特征，P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒涵盖全套试剂，允许试验者有效地在体内研究蛋白-DNA相互关系。
整个过程可以在6小时内完成（哇哦，厉害了~）当然了，还有相当重要的一点：P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒适用于将特异性免疫沉淀与定性和定量PCR、MS-PCR、ChIP-Seq、ChIP-on-chip结合使用。
欧迈噶！P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒包括一个ChIP级二甲基组蛋白H3-K9抗体--阳性对照，以及一个正常小鼠IgG——阴性对照。
从染色质从样本中释放出来后，经剪切、断片，添加到包被了抗体的微孔中，蛋白质-DNA复合物经特异性抗体捕获，解交联后DNA被释放，通过离心柱，纯化并洗脱目的DNA。
洗脱下来的DNA可用于各种下游应用。
接着看看样本，起始材料可包括各种植物组织（花、叶、幼苗）。
免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP
楼上说的准确的叫Co-IP。
IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。
而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
染色质免疫共沉淀实验步骤
染色质免疫共沉淀实验步骤英文回答：Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely used experimental technique that allows researchers to investigate the interactions between proteins and DNA in the context of chromatin. It is commonly used to study protein-DNA interactions, such as transcription factor binding, histone modifications, and chromatin remodeling.The ChIP experiment involves several key steps:1. Cross-linking: The first step is to cross-link the proteins to the DNA in living cells or tissues to preserve their interactions. This is typically done by treating the cells with a cross-linking agent such as formaldehyde. The cross-linking reaction is stopped by adding glycine, which quenches the formaldehyde.2. Cell lysis and chromatin fragmentation: The cross-linked cells are then lysed to release the chromatin. The chromatin is fragmented into smaller pieces by sonicationor enzymatic digestion. The goal is to obtain chromatin fragments of a suitable size range for subsequent immunoprecipitation.3. Immunoprecipitation: The fragmented chromatin is incubated with antibodies specific to the protein of interest. These antibodies recognize and bind to theprotein-DNA complexes. The protein-DNA complexes are then pulled down using protein A/G beads or magnetic beads coupled with antibodies. This step allows for the selective enrichment of the protein-DNA complexes of interest.4. Washing and elution: The pulled-down complexes are washed to remove any non-specifically bound proteins or DNA. The protein-DNA complexes are then eluted from the beads, usually by heat or enzymatic digestion, to release the DNA fragments.5. Reversal of cross-links: The cross-links between proteins and DNA are reversed by incubating the elutedprotein-DNA complexes at high temperature. This step dissociates the proteins from the DNA and allows for the recovery of the DNA fragments.6. DNA purification and analysis: The recovered DNA fragments are purified and can be further analyzed by various techniques, such as PCR, qPCR, microarrays, ornext-generation sequencing. These analyses can provide information about the protein-DNA interactions and the genomic regions bound by the protein of interest.ChIP experiments require careful optimization of various parameters, such as cross-linking conditions, chromatin fragmentation, antibody specificity, and washing conditions, to ensure the accuracy and reliability of the results. It is also important to include appropriate controls, such as negative controls (no antibody or non-specific antibody) and positive controls (known protein-DNA interactions), to validate the experimental conditions and results.中文回答：染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种广泛应用的实验技术，可以帮助研究人员在染色质的背景下探究蛋白质与DNA之间的相互作用。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）
（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）说明：以下实验方法使用了millipore公司的ChromatinImmunoprecipitation (ChIP) Assay Kit （Catalog #17-295）。
第一天（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出三个10cm平皿均匀种下细胞，在转录的最佳条件下培养，三个分别用来计数、对照、实验，待细胞数目达到约1×106时，直接加入270 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml）；2、37℃孵育10min；3、吸尽培养基，用冰冷的PBS（临用之前加入蛋白酶抑制剂PMSF使终浓度达到1mM）清洗细胞2次；4、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中，预冷后2000rpm 4℃离心 5min收集细胞；同时将SDS LysisBuffer从冰箱中取出平衡至室温；5、倒去上清，加入200 μl SDS LysisBuffer（对应细胞数为1×106，可以按照实际细胞数进行倍增）裂解细胞，并保证加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育10 min；6、超声破碎：VCX750，25%功率，4-5S冲击，9S间隙。
共14次，使DNA断裂成200-1000bp的片段，（第一次试验前可以加入8μl 5 M NaCl，65℃水浴4 h解交链，然后提取DNA进行电泳检测，以获得最适的超声破碎条件）。
（二）除杂及抗体哺育。
7、超声破碎结束后，13000 rpm 4℃离心10 min，转移上清至2 ml离心管中，取做实验，其余可以保存于-80℃冰箱中；8、300 μl中，100 μl加抗体作为实验组；100 μl不加抗体做为对照组；100 μl加入4 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果；9、在100 μl的离心上清液中，加入900 μl ChIP DilutionBuffer 和20 μl的50×PIC，再各加入60 μl ProteinA Agarose。
02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
染色质免疫共沉淀分组
染色质免疫共沉淀分组（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质结构和功能的技术，通常用于研究特定蛋白与DNA的结合以及与转录因子相关的基因调控元件。
在进行ChIP实验时，通常会根据实验目的和需要研究的具体基因或蛋白进行分组。
以下是一个可能的ChIP分组方案，共计800字：1. 组一：研究转录因子与DNA的结合实验目的：通过ChIP分析特定转录因子与DNA的结合位点，研究转录因子在细胞内的作用机制和基因调控网络。
实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对转录因子进行免疫沉淀。
（2）对照组：使用等量未被抗体结合的DNA进行免疫沉淀作为对照。
（3）质谱分析组：对免疫沉淀后的DNA进行质谱分析，鉴定出结合转录因子的特异性DNA 序列。
2. 组二：研究组蛋白修饰与染色质结构的关系实验目的：通过ChIP分析特定组蛋白修饰与染色质结构的关系，研究基因表达的调控机制。
实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对组蛋白修饰（如H3K36me2）进行免疫沉淀。
（2）对照组：使用等量未被抗体结合的DNA进行免疫沉淀作为对照。
（3）测序分析组：对染色质免疫沉淀后解旋的DNA片段进行测序，分析染色质结构的变化。
3. 组三：研究RNA聚合酶与基因转录的关系实验目的：通过ChIP分析RNA聚合酶与基因启动子的结合，研究基因转录的起始位点。
实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对RNA聚合酶进行免疫沉淀。
（2）基因组DNA组：分析免疫沉淀后提取的DNA是否含有预期的基因启动子区域。
（3）基因表达组：在相同条件下培养细胞，分析基因表达的变化，以验证RNA聚合酶与基因转录的关系。
以上是三种可能的ChIP分组方案，可以根据实验目的和具体需求进行调整和组合。
通过ChIP 技术，我们可以深入了解基因表达调控的机制，为疾病研究和药物开发提供重要基础数据。
CHIP(染色质免疫共沉淀)
一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。
洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。
染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程
染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。
胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml 的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。
吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，达到最终体积2ml。
8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋转30分钟。
9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。
10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。
11.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度旋转一小时。
12.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
13.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀14.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀15.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀16.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次17.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,0.1M NaHCO3)。
CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
概述
原理
方法 比较 举例
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理
方法 比较 举例
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质 小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测
概述
原理
方法 比较 举例
应用举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
概述
原理
方法 比较 举例
比较：
蛋白质-DNA相互作用常用方法
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA）
体 外
体 内
DNaseⅠ足迹法（foot printing）
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
概述
原理
方法 比较 举例
EMSA
CHIP
由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控 结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与 的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因 地反映体内转录调控 组区域或确定与特定 蛋白和DNA结合的状况。基因组区域结合的蛋 白质的最好方法。
CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol
CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。
其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。
实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。
实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。
实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。
实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。
2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。
3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。
4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。
5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。
注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。
常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。
总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。
同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍
背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。
步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。
实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。
实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。
注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。
）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ulsterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方法及步骤详解
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方法及步骤详解实验方法原理在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验材料细胞样品试剂、试剂盒甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒仪器、耗材离心管超声仪电泳仪离心机实验步骤一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项
染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项【前言】早期，人们就发现在细胞的生命活动中，DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白质相互作用，很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。
近年来，随着研究的深入，很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊径，深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。
染色质免疫共沉淀（ChIP）作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法，深得人心。
很多人都希望接触和掌握此实验技术，希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制，进而开发相应的药物。
总之，ChIP是一个有效且重要的实验技术。
下面就来聊聊它。
【正文】能够与DNA结合的蛋白有多种，主要分为组蛋白和非组蛋白。
一方面，染色体是由组蛋白和DNA构成的，组蛋白作为染色体的结构蛋白，可以与DNA形成核小体，组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的，因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。
NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。
（核小体结构图）另一方面，非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白，包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等，它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的，发挥完作用可能就及时脱离开了。
ChIP实验原理：在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。
从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分5步：（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联；（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；（5）DNA 纯化回收；（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 DNA实验技术方法汇总
染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
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ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案
染色质免疫沉淀-芯片试剂盒
染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。
通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。
芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。
会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。
然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。
如果没有设置阴性和阳性
对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。
经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。
在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。
洗脱的DNA可直接用于后续分析该套件基于96孔板，是市场上同类产品中最快的套件。
CHIP过程完全简化，操作简单，整个处理过程在不到5个小时的时间内就很容易学会。
同时，可拆卸的96孔板模式使研究人员能够根据自己的需要选择手动或高通量分析。
用于
组织样本的芯片套件(P-2003):专为组织样本开发，更专业，使用更方便！
植物芯片研究的福音:独特的植物染色质免疫沉淀试剂盒(p-2014)，极大地拓展了染色质免疫沉淀的应用领域，给从事植物研究的教师带来了新的希望。
植物染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒提供植物细胞样品
上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂一旦推出，它将受到广大科研人员的喜爱！
高灵敏度芯片套件(p-2027):最新一代的高灵敏度产品只是为了更好的结果！优化后的方案和组分减少了非特异性背景，提高了目标蛋白-DNA复合物的收集量该试剂盒收集的DNA可用于各种下游研究，如聚合酶链反应(芯片-聚合酶链反应)、微阵列(芯片-芯片)和测序(芯片-序列)
最快芯片套件:彩光一步磁性芯片套件(P-2026)是一步芯片套件(磁珠)，配套的附加多功能生物处理器1100(EQC-1100)和96孔磁性支架(Q10002-1)效果更好！
ChIP-Seq文库专用试剂盒(Illumina platform):该试剂盒可选择性富集含有不同物种(尤其是哺乳动物)特异性DNA序列的染色质片段，构建ChIP-Seq该文库使用Illumina平台的下一代测序技术，如Illumina基因组分析仪2、HiSeq和MiSeq。
优化后的方案和组分可以用亚纳克级起始DNA进行非条形码序列(单个)和条形码序列(多个)的DNA文库构建。