第七章 发酵产品的分离纯化

亲和层析是最有效的生物活性物质纯化 方法，它对生物分子选择性的吸附和分离， 可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯 化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后， 性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。 此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间， 对不稳定蛋白的纯化十分有利。
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其它 扩张床吸附
吸附介质颗粒在向上流动的上清的作用下扩 张起来，上清中的目标蛋白被吸附于介质上， 而细胞和其碎片将通过柱子而流出去，而洗 脱目标蛋白时从相反方向将吸附介质压紧， 再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗下来。通过扩 张床吸附技术可大大减少上清的处理时间。
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2.3 按发酵时目的产物所在的位置分类 cell 内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、 重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、 胞外酶（α-淀粉酶）等
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3.生物下游加工过程的重要性 1)、生化产品的必经的过程 2)、中药现代化的重要技术平台 3)、提高产品竞争力的关键技术之一
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小结
蛋白质的纯化无固定的模式，不同的蛋 白质有不同的纯化方法，同一种蛋白质 也可采取不同的纯化方法，但最终得到 的蛋白质其稳定性和纯度也有所差别， 这就涉及到操作者的实践经验及对纯化 艺术的理解。
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蛋白质的提取与纯化技术 蛋白质的提取
蛋白质的分离纯化
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提取：把蛋白质从原来的组织或细 胞中以溶解的状态释放出来，保持 天然状态。 分离纯化：将所要的蛋白质与其他 杂蛋白分离开来。
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蛋白质的提取 a.水溶液提取 b.有机溶剂提取
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水溶液提取应注意的因素: 盐浓度 pH值 温度 对提取物的保护 表面活性剂
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蛋白质的分离纯化
根据蛋白质溶解度不同的分离方法 根据蛋白质分子大小差别的分离方法 根据蛋白质带电性质进行分离 根据配体特异性的分离方法 其它
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蛋白质溶解度不同的分离方法
蛋白质的盐析
(根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此 分离的方法)
等电点沉淀法
(各种蛋白质的等电点有差别,利用调节溶液pH达到某一蛋白质的等电 点使之沉淀)
低温有机溶剂沉淀法
(利用与水可混合的有机溶剂降低溶液的介电常数,导致蛋白质溶解度 降低而析出)
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根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
透析与超滤
(透析法:利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开) (超滤法:利用高压力或离心力强使水及小分子物质通过半透膜,而蛋白质 大分子被截留在膜上,达到分离)
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3.目标物质稳定性差 4.下游加工过程有弹性 5. 注意生物安全性
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三、生物下游加工过程的一般流程
动、植物组织、体液等 胞外产物 提取 精制 → 制成品 分子筛 无菌过滤 离 子 超滤 亲 和 冻干 吸 附 喷干 憎 水 结晶
发酵液 → 预处理 → 分离 → 破碎 → 碎片分离 → 初步纯化 → 培养液 加 热 沉淀 匀化 离心 沉淀 酶反应 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸附 酶溶 絮凝 过滤 胞 过滤 萃取 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤
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4.生物下游加工过程工程的研究内容可分 为： （1）确立最佳的分离方法 （2）确定最佳的分离工艺流程和操作条 件 （3）分离设备的选型和设计
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二、生物下游加工过程的特点 1.培养液成分复杂 2.目标物质含量低，而杂质浓度高
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几种典型产品发酵液的浓度 产品 单克隆抗体 酶 抗生素 有机酸 氨基酸 典型浓度/（g/L） 0.5 20 25 100 100
第七章 发酵产品的分离纯化
王志江 生物科学系
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第一节 生物下游加工过程概述
一、生物下游加工过程
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1.基本定义： 生物下游加工过程 生物化工产品通过微生物发酵过程、 酶反应过程或动植物细胞大量培养获得 培养液，从上述培养液中分离、精制有 关产品的 过程为生物下游加工过程
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离子交换层析
(当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反的蛋白质 被吸附在离子交换剂上,随后,通过改变pH或离子强度使吸附的蛋白质洗脱下 来)
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根据配体特异性的分离方法
亲和色谱法
(利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化)
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生化分离工程 根据分离过程原理（物理化学、化工 原理、传递过程等）来研究分离过程的 开发和设计中遇到的一些带有共性的技 术问题的学科
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2 .生化产品的类型 2.1 按用途分类 食品类 农业用产品 医用类产品 生物试剂类
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2.2 按分子量大小分类 分子量 < 1000Da：抗生素、有机 酸、氨基酸、多肽类等 分子量 > 1000Da ：酶、抗原、抗 体、多肽、蛋白质类
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分离蛋白质的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学 性质，需要纯的均一的蛋白质样品。 研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天 然构象。
制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提 纯到规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质 的成分除去。
影响蛋白质稳定性的因素
温度 蛋白酶 缓冲溶液 摇动剪切 高压
凝胶过滤
(利用凝胶颗粒为固定相,小分子物质能进入颗粒内部,而大分子却排阻在 外,当混合液通过凝胶柱,溶液中的物质就按不同分子量大小筛分开了)
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凝胶过滤原理
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两组分的凝胶层析分离及洗脱曲线
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根据蛋白质带电性质进行分离 电泳法
(各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数的不同而在电场中的迁移率不同 而得以分开)
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例子：紫杉醇的纯化过程简介 红豆衫树皮
预处理
萃取
层析
紫杉醇
第二节 产品的分离纯化
蛋白质的分离纯化技术
Leabharlann Baidu 发酵工程篇
概述 影响蛋白质稳定性的因素 蛋白质的分离提纯技术 小结
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蛋白质是一类重要的生物大分子，英文名 称protein，字源出自希腊文Προτο, 它有“最原初的”、“第一重要”的意思
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盐浓度
稀浓度可以促进蛋白质的溶解,同时稀盐 溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保 护蛋白质不易变性的优点,因此在提取时 加入少量NaCl等中性盐,一般浓度为 0.15mol/l为宜.
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pH值 蛋白质是具有等电点的两性电解 质,提取液的pH值应选择在偏离等 电点两侧的pH范围内.