【生物工程下游技术】第七课_双水相萃取
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第七章 双水相萃取技术
有机溶剂萃取的不足：
许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件 下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有 可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移 到另一水相中，从而完成分离任务。
这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：
① 与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体
中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高； ② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张 力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液 滴在10μ m以下，有很大的表面积，有利于底物和 产物的传递。
保持生物活性和强化相际间的质量传递 ② 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般 只有5～15min。 ③ 双水相萃取技术易于连续化操作。 ④ 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物
有较高的收率。
⑤ 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液 分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2 个分离步骤,使 整个分离过程更经济。 ⑥ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
(5)体系中微生物的影响。
1）表面自由能的影响
2）表面电荷的影响
道南电位(, Donnan potential):实际双水相系统中有电解质, 当这些离子在两相中K 1, 则两相间产生电位差
U2，U1——相1和相2的电位 Z+, Z－ ——分别表示一种盐的正负离子的离子价
F——法拉第常数 T——温度
器。
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
substrate
product
Enzymetic reaction with ATPS
enzyme
enzyme
enzyme
要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：
① 催化剂应单侧分配；
② 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另 一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中， 则相比要大，反之则相比要小。
B
成相聚和物浓度的影响
当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近 于 1。 如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时， 系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别 也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过 1，或减小低于1。
(2)体系中无机盐离子的影响
聚合物的不相溶性：
主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗
透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的 水相，所以具有强烈的相分离倾向。
某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓
度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系
双水相萃取技术的优点
① 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低,有助于
同种类的盐时，由于相间电 位不同， lnk–pH 关系曲线也 不一样。但在 pI 处， k 应相 同，即两条关系曲线交于一 点。所以 , 通过测定不同盐 类存在下 lnk–pH曲线的交点 , 可测定蛋白质 / 细胞器以及 微粒的pI。
血清蛋白
(4)体系温度的影响
温度影响小 , 一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操 作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会 发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用.
PEG/盐更适合用重力沉降； PEG/DeX多用离心机。
2. 两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以 把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃
取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应
一、 双水相分离理论
1、双水相的形成
熵增——混合——自发 分子间作用力------随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发 生分相的现象.
常用聚合物： 聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统
无毒原则
2、相图
临界点(critical point)：当 系线长度趋于零时, 两相差 别消失,任何溶质在两相中 的分配系数均为1。如C点。
三、 双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离
子基团；
2. 采用多级萃取。
作业：
1.Βιβλιοθήκη 第七章 双水相萃取普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是： (1) ;(2) 2. 生物工程中常用的双水相体系主要 有： ， 等体系。 3. 聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系的相图是一条双节 线。双节线 下方为 ，双节线上方即 为 ，两相分别有不同的组成和密度。上相主要 含 ，下相主要含 。 4. 在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（PEG）/葡聚糖 （Dex）双水相体系中分配的因素有哪些?分配系数K分别怎 样变化? 5. 请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。
(3)体系PH的影响
pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白 质所带电荷和分配系数。
pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间 的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的 微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。
交 错 分 配 法 (cross partitioning): 当 加 入 不
要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：
① 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；
② 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时， 经过一次萃取，就能得到高的收率； ③ 两相用离心机很容易分离。
工程方面的问题
在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时 间和两相分离的设备。
在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进 行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且 能耗也很少。 两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理 匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采 用自动排渣的喷嘴分离机。
盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差， 由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的 萃取来说 ,盐的存在就会使系统的电荷状态改变 ,从而对分 配产生显著影响。 （P137） 盐的种类对双水相萃取也有一定的影响 ,因此变换盐的种类 和添加其他种类的盐有助于提高选择性。 在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐 /水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到 1 2 0 ,而在 PEG/DeX/水体系中只从 1 . 55提高到 5。
3）综合考虑
4）影响分配平衡的参数
(1)聚合物的影响
A
聚和物的分子量的影响
当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的 相。例如在PEG—DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分 配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。 这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。 (P135)
进一步可证明： ZiF(U2-U1) RT
InKi*= InKi+
Ki*——i组分带电时在体系中的分配系数 Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数 Zi——i组分的离子价
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与 溶质的净电荷数成正比. B 由于同一双水相系统中添加不 同的盐产生的不同,故k与Zi的 关系因盐而异。
两相区 均 相 区 双节线 系线
聚合物的分子量越高，相分离 所需的浓度越低 两种聚合物的分子量相差越 大，双节线的形状越不对称。
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。 CT K= —— CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (3)体系PH的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (4)体系温度的影响；
二、 双水相萃取技术的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。
目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
有机溶剂萃取的不足：
许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件 下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有 可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移 到另一水相中，从而完成分离任务。
这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：
① 与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体
中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高； ② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张 力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液 滴在10μ m以下，有很大的表面积，有利于底物和 产物的传递。
保持生物活性和强化相际间的质量传递 ② 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般 只有5～15min。 ③ 双水相萃取技术易于连续化操作。 ④ 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物
有较高的收率。
⑤ 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液 分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2 个分离步骤,使 整个分离过程更经济。 ⑥ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
(5)体系中微生物的影响。
1）表面自由能的影响
2）表面电荷的影响
道南电位(, Donnan potential):实际双水相系统中有电解质, 当这些离子在两相中K 1, 则两相间产生电位差
U2，U1——相1和相2的电位 Z+, Z－ ——分别表示一种盐的正负离子的离子价
F——法拉第常数 T——温度
器。
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
substrate
product
Enzymetic reaction with ATPS
enzyme
enzyme
enzyme
要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：
① 催化剂应单侧分配；
② 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另 一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中， 则相比要大，反之则相比要小。
B
成相聚和物浓度的影响
当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近 于 1。 如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时， 系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别 也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过 1，或减小低于1。
(2)体系中无机盐离子的影响
聚合物的不相溶性：
主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗
透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的 水相，所以具有强烈的相分离倾向。
某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓
度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系
双水相萃取技术的优点
① 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低,有助于
同种类的盐时，由于相间电 位不同， lnk–pH 关系曲线也 不一样。但在 pI 处， k 应相 同，即两条关系曲线交于一 点。所以 , 通过测定不同盐 类存在下 lnk–pH曲线的交点 , 可测定蛋白质 / 细胞器以及 微粒的pI。
血清蛋白
(4)体系温度的影响
温度影响小 , 一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操 作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会 发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用.
PEG/盐更适合用重力沉降； PEG/DeX多用离心机。
2. 两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以 把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃
取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应
一、 双水相分离理论
1、双水相的形成
熵增——混合——自发 分子间作用力------随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发 生分相的现象.
常用聚合物： 聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统
无毒原则
2、相图
临界点(critical point)：当 系线长度趋于零时, 两相差 别消失,任何溶质在两相中 的分配系数均为1。如C点。
三、 双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离
子基团；
2. 采用多级萃取。
作业：
1.Βιβλιοθήκη 第七章 双水相萃取普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是： (1) ;(2) 2. 生物工程中常用的双水相体系主要 有： ， 等体系。 3. 聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系的相图是一条双节 线。双节线 下方为 ，双节线上方即 为 ，两相分别有不同的组成和密度。上相主要 含 ，下相主要含 。 4. 在恒温恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（PEG）/葡聚糖 （Dex）双水相体系中分配的因素有哪些?分配系数K分别怎 样变化? 5. 请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。
(3)体系PH的影响
pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白 质所带电荷和分配系数。
pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间 的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的 微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。
交 错 分 配 法 (cross partitioning): 当 加 入 不
要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：
① 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；
② 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时， 经过一次萃取，就能得到高的收率； ③ 两相用离心机很容易分离。
工程方面的问题
在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时 间和两相分离的设备。
在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进 行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且 能耗也很少。 两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理 匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采 用自动排渣的喷嘴分离机。
盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差， 由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的 萃取来说 ,盐的存在就会使系统的电荷状态改变 ,从而对分 配产生显著影响。 （P137） 盐的种类对双水相萃取也有一定的影响 ,因此变换盐的种类 和添加其他种类的盐有助于提高选择性。 在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐 /水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到 1 2 0 ,而在 PEG/DeX/水体系中只从 1 . 55提高到 5。
3）综合考虑
4）影响分配平衡的参数
(1)聚合物的影响
A
聚和物的分子量的影响
当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的 相。例如在PEG—DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分 配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。 这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。 (P135)
进一步可证明： ZiF(U2-U1) RT
InKi*= InKi+
Ki*——i组分带电时在体系中的分配系数 Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数 Zi——i组分的离子价
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与 溶质的净电荷数成正比. B 由于同一双水相系统中添加不 同的盐产生的不同,故k与Zi的 关系因盐而异。
两相区 均 相 区 双节线 系线
聚合物的分子量越高，相分离 所需的浓度越低 两种聚合物的分子量相差越 大，双节线的形状越不对称。
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。 CT K= —— CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (3)体系PH的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (4)体系温度的影响；
二、 双水相萃取技术的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。
目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。