人源化单克隆抗体制备工艺共30页文档
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
单克隆抗体制备方法共24页
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
单克隆抗体制备方法4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
人源化单克隆抗体制备工艺
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法课件
and selected clones on the
basis of their ability
to recognize the tetrameric but not the
monomeric form of the channel.
ELISA
抗體生產： 1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右； 腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。 2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫 時 間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。 4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰ • 硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 • 離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。 • 膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。
软琼脂平板法。
单抗制备过程的影响因素
A.
污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。
B. 融合后杂交瘤不生长 ：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性 或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了 支原体。 ④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
5.1单克隆抗体人源化
第五章 人源性抗体第一节单克隆抗体人源化通常我们制备的单克隆抗体来源于小鼠，这种抗体若用于人体的治疗，由于抗体的免疫性会诱发机体产生人抗鼠反应，会给机体造成损伤，同时降低药物的疗效。
因此，为了解决这个问题，我们需对鼠源抗体进行人源化改造。
在学习单克隆抗体人源化之前，我们首先来回忆下抗体的基本结构与功能（图1）。
以IgG类抗体为例，抗体是由2条相同的重链和轻链通过二硫键形成的4肽链结构，其中，重链包含一个可变区（VH区）和三个恒定区（CH区）轻链包含一个可变区（VL区）和1个恒定区（CL区）。
重链和轻链的可变区构成特异性识别抗原的区域，可变区中又有超变区（CDR区），重链和轻链可变区中各自有3个超变区，这些超变区构成最直接结合抗原的区域。
图1 抗体的基本结构模式图单克隆抗体人源化就是在保留抗体特异性的前提下降低其免疫原性的过程，因为非人源性抗体进入人体内会引起严重的机体排异反应，进而影响抗体在临床应用时的安全性和治疗效果，因此需要对抗体进行人源化改造，最大程度降低抗体的异源性，并且使其特异性和亲和力保持不变。
单克隆抗体的人源化发展经历了嵌合抗体、人源化抗体及全人源性抗体等3个阶段（图2）。
图2单克隆抗体的人源化发展历程鼠/人嵌合是嵌合抗体的主要类型，由鼠源性抗体的可变区(V区)与人源抗体的恒定区(C区)拼接而成。
优点是保留了鼠源性抗体与抗原结合的特异性和亲和力，又降低或消除了部分鼠源性抗体作为异源蛋白对人体的免疫原性。
第二代人源化抗体就是指CDR移植抗体，也是指现在通常所说的人源化抗体。
因为CDR的氨基酸序列和空间结构有多态性，是决定抗体的特异性和亲和力的关键因素。
所以，我们在做鼠源单抗人源化时仅保留6个鼠源单抗的CDR区，其它区域均换成人源的，人源化抗体的人源性部分可达90%以上。
CDR移植技术的理论依据是CDR是决定抗原结合位点的唯一结构，因而也是抗体特异性和亲和力的决定部位，而框架区能够接受外源成分的植入。
全人源化单抗(Fully Human Monoclonal Antibody)
全人源化单抗（Fully Human Monoclonal Antibody）人源化 mAb 基本上解决了鼠抗体的最重要问题——免疫原性，但是人源化过程仍很繁复且费用昂贵，它需要广泛的计算机模型设计，即使如此，大量反复试验仍不可避免，因为要试验各种氨基酸置换以测定对目标选择性和结合亲和力的有害作用。
而全人源化单克隆抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化的目的。
目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。
抗体库技术抗体库技术包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：是利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ（PⅢ）或外壳蛋白Ⅷ（PⅧ）基因随机重组，继而感染大肠杆菌，后经增殖并在噬菌体表面以抗体片段 Fab 或单链抗体可变区（ScFv）一外壳蛋白的融合蛋白形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程，就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
其最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的 DNA 在体外进行转录与翻译，由于对 DNA 进行了特殊的加工与修饰，如去掉3′ 末端终止密码子，核糖体翻译到 mRNA 末端时，由于缺乏终止密码子，停留在 mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA 三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在 ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的 mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR 产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
肿瘤单克隆抗体的制备PPT课件
在纯化抗体前, 必须采用商品化的抗Fc 段 同种型免疫学试剂先行测定其重链所属的类 型, 如抗体属于对A 蛋白亲和力弱的一类( 如 人的IgG3) , 就必须使用其他方法。
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嵌合抗体检测
Western 印迹法是检测抗体的常用方法。此 种技术是把电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至 一种固相支持体, 并以针对特定的氨基酸序列的 特异性试剂检测之。对于嵌合抗体来说, 通常使 用的探针为抗体。
类风湿关节炎 强直性脊柱 炎 银屑病 Crohn氏病等
菌血症 病毒性感染 呼吸 道融合病毒感染等
等
抗体亲和力成熟问题 、 全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定 性问题、抗体大规模生产问题、治疗费用昂贵等
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25
Zenapax 特异性人源化IL-2受体抗体，可特异性抑制 T细胞介导的移植免疫反应。作为第一个人源化单 抗于1997年投放市场。
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5
未来发展方向
目前，抗体人源化方法还在不断发展和晚 上，目标是提高抗体亲和力、降低抗体异 原性，同时兼顾抗体的免疫活化作用。另 外，针对不同的异源抗体。选择合适的人 源化途径构建更适合于临床应用的人源化 抗体，将为新药的开发和一些顽固的治疗 开辟新的途径。
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6
发展
恒定区人源 化
可变区人源 化
利用抗体库技 术获得完全人
1，合成抗体库及小鼠转基因技术
（一）合成抗体( Syntheticantibody library)。
1，在对人或鼠抗体序列和主体结构进行分析的基础上, 合成 多条VH和VL基因, 用来替代所有的抗体类别和结构, 组成多个 总抗体库。
2，转基因小鼠的鼠抗体生成基因被相应的人基因取代，利 用肿瘤抗原如EGFR 免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠 可制备高亲和力和特异性的抗体。
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46、寓形宇内复几时，曷不委心任去 留。
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47、采菊东篱下，悠然见南山。
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48、啸傲东轩下，聊复得此生。
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49、勤学如春起之苗，不见其增，日 有所长 。
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50、环堵萧然，不蔽风日；短褐穿结 ，箪瓢 屡空， 晏如也 。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道