酶活力的测定
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
ABTS法测酶活
ABTS 法测酶活
1、先配制0.1mol/L 的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH =4.0）；
2、再配制0.5mmol/L 的ABTS ；（0.5mmol/L ABTS ：0.27434g ABTS 加入到1L 纯水中溶解即可。
（分子量为548.67））
3、在无菌的环境中提取1mL 的粗酶液，放入EP 管内；
4、用离心机对其离心（8000转2分钟），取上一定量的上清液，用醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释一定的倍数；
5、取一定量的ABTS 试剂，和稀释后的酶液分别在不同的试管内进行水浴（40℃，10min ）；也将比色皿冲洗干净放在干燥箱里，温度调到40℃；
6、尽量保持在40℃的温度下混合ABTS 和稀释后的酶液（比例1:1），当两种液体混合时开始计时，记录下第30s 和90s 两个时间点分光光度计的显示数（λ=420nm ）；
7、定义1 个酶活力单位用每分钟1μmol 的ABTS 被转化所需的酶量。
（原理是ABTS 被Lac 氧化，氧化产物的消光系数ε为3.6×104（mol/L ）-1·cm -1），所以酶活的换算按照下列公式：
t 10
6.31043
∆∆⨯⨯⨯D 酶液总体积反应液总体积。
酶活力的测定方法
酶活力的测定方法
酶活力咋测？嘿，有办法。
先准备好材料，就像要去打仗得有武器。
然后按照步骤来，可不能瞎搞。
注意啥呢？温度得控制好呀，不然酶活性乱了套，那可完蛋啦。
还有时间也得把握准，就像做饭不能糊了锅。
安全不？只要你操作规范，没啥问题。
就像走路走得稳就不会摔跟头。
稳定性嘛，只要条件控制好，结果就比较靠谱。
就像盖房子基础打好就不会歪。
啥时候用这方法？做实验、研究的时候呗。
优势可不少呢，能知道酶有多厉害，就像给酶做个体检。
我见过人家测酶活力，那数据准得很。
就像神枪手打靶，百发百中。
测酶活力有门道，弄好了超棒。
你还等啥呢？赶紧试试吧！。
05-01-024常规测定酶活力的步骤(精)
天津现代职业技术学院
常规测定酶活力的步骤
酶活力测定一般包括两个阶段：首先，在一定条件下将酶与底物混合反应一段时间；然后，测定反应液中底物或产物量的变化。
常规测定酶活力的步骤如下：
1)酶液的稀释
2)选择合适的底物
3)确定酶促反应的最适条件
根据资料或试验结果，确定酶促反应的最适条件，包括底物浓度、最适温度、最适pH、适当稀释的酶液和严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。
有些酶促反应，要求有激活剂等其它条件，应根据需要适量添加。
4）反应时间必须准确
反应体系必需预热至规定温度后，加入酶液并立即计时，达到反应时间后，应立即灭酶活性，终止反应的进行，并记录终了时间。
5）反应量的测定
测底物减少量或产物增加量均可。
因为酶促反应底物的浓度一般都很高，少量底物的消耗量较难测准；而产物则是从无到有，变化明显，测定较为灵敏准确，所以，一般大都测定产物的增加量即生成量。
1。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
5酶类药物的分析检验
3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底 物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物 都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉 淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和 两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能 生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以 根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物 才是真正由酶促反应所生成的产物量。
（二）酶活力测定的方法：
酶活力测定要符合两个原则： ①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与 反应时间t成正比， ②反应速度与酶量成线性关系，即 〔E〕= k(-〔s〕/ t) = k〔p〕/ t k(k〔 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法
如何测定酶活力？ 如何测定酶活力？
以产物浓度对反应时间作图， 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反 应速度曲线
产 物 浓 度
注意：初速度的 注意： 测定是关键， 测定是关键，为 什么？ 什么？
0
时间
可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着时间的延长，反应速度逐渐下降 随着时间的延长，
国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。 但也有不少缺点，如 ：①从惯用单位换算成国际单位比较麻 烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白 酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微 摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时， 其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的 不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这 也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不 同的。
【重点掌握】 重点掌握】
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活力及蛋白含量测定
酶活力的测定：
1 ． 样 品 前 处 理 ： 测 定 E1 、 E2 、 E3 酶 活 时 ， 用 pH4.6, 0.2mol/L的醋酸缓冲液进行稀释。（E1稀释5倍、10倍、 20倍；E2稀释50倍、100倍; E3稀释20倍，50倍）
取两支试管分别加入用 pH4.6,0.2mol/L 的醋酸缓冲液适 当稀释过的酶液2ml； 一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（对 照取E1 20倍稀释 1管即可）； 另一支做测定管； 把两支试管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 ℃水浴中预热恒温 （10min）； 分别取 2ml 5% 的蔗糖加入上述两试管中，开始计时，准 确反应3分钟，于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇 匀，终止反应。
蛋白含量的测定：
样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀 成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测定）同 工作曲线的制作。 蛋白质浓度的计算：
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
Pr (mg/ml)=
测定E1蛋白含量（大约稀释200、100倍），测定E2蛋白 含量（大约稀释50、20倍），测定E3蛋白含量（大约稀 释50、20、10倍），用去离子水稀释即可。
[E] = (葡萄糖mg数×(4.5/0.5)×E的稀释倍数/2ml)/2
蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克 还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 注意：在测定E1、E2、E3酶活力和蛋白浓度时，应留取少许样 品（100μml左右），留作电泳实验。 注：在正交试验的测定中，共需稀释到50U/mL的E3约为12mL。
2. 酶活力的测定：从两个反应试管中各取出 0.5ml 溶液放入血 糖管中，加入 3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和 1.5ml 水，摇匀， 于沸水浴中准确反应 5min，立即用冷水冷却，加水稀释至 25ml，摇匀，于540nm的葡萄糖含量毫克数，按下面公式计算酶活力：
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
第6章酶化学 第五节 酶的活力测定
第六章 酶化学
• 第一节 概述 • 第二节 酶的命名和分类 • 第三节 酶催化反应的机理 • 第四节 影响酶促反应速率的因素——酶促反应动力学 • 第五节 酶的活力测定 • 第六节 食品工业中重要的酶及其应用
食品生物化学
学习目标
1.掌握酶的化学本质及作用特点。 2.了解酶的命名及分类。 3.掌握酶催化反应的机理。 4.掌握温度、pH、酶浓度、底物浓度、竞争性抑制、非竞 性抑制物及激活剂对酶促反应速率的影响。 5.掌握酶活力的概念及测定酶活力的方法。 6.熟悉食品工业中重要的酶及其应用，了解固定化酶。
食品生物化学
第五节 酶的活力测定
一、酶的活力和活力单位
1．酶活力
通常用单位时间内酶催化某一化学反应的能力来表示酶的 催化能力，即用酶活力大小来表示酶的催化能力。酶活力的大 小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表 示，两者呈线性关系。酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高； 反应速率愈小，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定 酶促反应的速率。由于酶催化某一反应的速度受多种因素限制， 故一般规定在某一条件下(恒温、使用缓冲溶液)用反应速率的 初速率来表示酶活力。
60 20 2% 1 1000 4800单位/ 克酶制剂
10
0.5
2．测定一定时间内所起的化学反应量
这是酶活力测定的主要方式，用测定反应量来计算酶活力。 主要是根据在一定条件下，酶反应速率与酶浓度成正比，测定 反应速率就可求出酶的浓度。
食品生物化学
测定结果的正确与否，即能否真实地反映酶活力，是和酶 反应的条件是否适宜密切有关。适宜的条件是使所有的酶分子 都能正常地发挥作用，反应条件中应使酶浓度是影响反应速率 的唯一因素，而其他条件如pH和温度应保持最适水平。此外测 定用的底物应当使用足够高的浓度，使酶催化的反应速率不受 底物浓度的限制。为了测定简便，选用的底物最好在物理或化 学性质上和产物有所区别。
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。
酶活性测定
实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。
后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12 次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0. 4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品 37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进 样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起, 所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系 统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分 析。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
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实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。
血清中的过氧化氢酶（CA T）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CA T 的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。
[试剂与器材]
试剂：
1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。
2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。
3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。
器材：
721分光光度计, 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。
[实验步骤]
1、样品测定：基质液置于37℃水浴5 min，然后按下列步骤操作
试剂对照管标准管测定管
基质液 1.0ml 1.0ml 1.0ml
钼酸铵 1.0ml 1.0ml —
缓冲液—0.2ml —
血清0.2ml —0.2ml
37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。
记录各管吸光度值（A）
2、计算：
过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）
= [(A对－A测)/ A标]×325
(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量，1000为μmol换算成mmol)
[方法评估]
本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。
此法操作简便、准确，在实验时间（1小时）内显色稳定，适于科研和实验检验用。
[应用意义]
CA T具有重要的生理功能，细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类（如氨基酸氧化酶等）同时存在，能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。
此外，CA T清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害，因而有抗衰老和保护作用。
[注意事项]
1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系，故选用60秒为测定时间（所以本法不宜大批量样品同时测定，以每批4～5份为宜）。
2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系；钼酸铵和H2O2呈色反应在pH＜7时吸光度升高，当pH＞7.6时吸光度下降，故选用pH7.4作为测定条件。
3、黄色复合物至少在1h内稳定。
4、血清不能溶血，溶血样品应该弃去。
5、加入钼酸铵后，由于释放O2，气泡会干扰比色，宜在显色10min后比色。
[思考题]
1、试述过氧化氢酶的测定方法？
2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒？
3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制？
淀粉酶活力的测定（必修）
[目的与原理]
掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。
淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。
在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。
[试剂与器材]
试剂：
1、0.04%可溶性淀粉
精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。
继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml 刻度。
此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。
2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。
3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。
材料：
新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材：
分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。
[实验步骤]
1、酶提取液的制备
取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。
2、（见实验蛋白酶活力的测定）
2、淀粉酶活力的测定
取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。
对照管测定管
0.04％可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml
将两管在37℃水浴中预热2—5分钟
酶液—0.1ml
测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟
0.01N碘应用液 5.0ml 5.0ml
用蒸馏水稀释至50ml，立即混匀。
用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。
3、计算
淀粉酶活力单位定义：在370C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg 称为一个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活力单位/100ml＝（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800
[方法评估]
测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。
本实验采用前者的淀粉—碘比色法。
[应用意义]
分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。
认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学依据
[注意事项]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位／100ml（即：2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800）。
2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。
3、当淀粉酶接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。
4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。
5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。
[思考题]
1、试述淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力的原理？
2、影响淀粉酶活力大小的因素有哪些？。