(整理)TCID50概念方法.
TCID50 MOI PFU意义及其换算
/viewthread.php?tid=7423&page=1Multiplicity of infection (MOI)The multiplicity of infection (abbreviated MOI) is the average number of phage per bacterium. The MOI is determined by simply dividing the number of phage added (ml added x PFU/ml) by the number of bacteria added (ml added x cells/ml). The average number of phage per bacterium in the population could be 0.1, 1, 2, 10, etc, depending upon how you setup the experiment.Although the MOI tells you the average number of phage per bacterium, the actual number of phage that infect any given bacterial cell is a statistical function. For example, if the MOI is 1, some cells will get infected with one phage but some cells may be infected with 0 phage and other cells infected with two phage. The proportion of cells in a population infected by a specific number of phage (n) can be calculatedfrom the Poisson distribution.PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
tcid50计算方法
tcid50计算方法一、什么是tcid50tcid50是一种用于测定病毒感染力的计算方法，全称为50%组织培养传染量（50% tissue culture infectious dose）。
简单来说，tcid50是表示50%感染组织培养细胞所需的病毒数量。
要计算tcid50，需要进行以下步骤：1. 首先，将待测病毒样品进行一系列稀释。
通常，会进行10倍的稀释，如1:10、1:100、1:1000等。
每个稀释液通常都设置3个或更多的重复。
2. 将每个稀释液分别接种到细胞培养板中的细胞上。
细胞培养板通常分为96孔板，每孔有一定数量的细胞。
3. 在接种后，将细胞培养板放入恰当的条件下培养，让病毒感染细胞。
4. 一段时间后，观察细胞的变化。
如果细胞被病毒感染，细胞会出现病毒感染的特征，如细胞形态改变、细胞死亡等。
5. 根据观察结果，记录每个稀释液中感染细胞的情况，包括阳性孔和阴性孔的数量。
6. 使用统计学方法，计算出50%感染组织培养细胞所需的病毒数量。
这个数量就是tcid50值。
三、tcid50的应用tcid50是一种常用的病毒感染力测定方法，广泛应用于医学、生物学、农业等领域的研究中。
它可以用来评估病毒的感染力，研究病毒的病原性、传播途径等。
在疫苗研发中，tcid50可以用来评估疫苗的有效性。
疫苗通常会被稀释后接种到细胞上，通过计算tcid50可以确定疫苗的效果，以及需要接种多少疫苗才能达到预期的免疫效果。
tcid50还可以用于病毒感染的流行病学研究。
通过测定不同病毒株的tcid50值，可以比较它们的感染力，从而了解病毒的传播途径、传播速度等信息。
总结：tcid50是一种常用的病毒感染力测定方法，通过稀释病毒样品、接种细胞培养板、观察细胞变化等步骤，计算出50%感染组织培养细胞所需的病毒数量。
tcid50的应用广泛，可以用于评估疫苗的有效性，研究病毒的病原性和传播途径等。
通过tcid50的计算，可以更好地了解病毒的特性，为疫苗研制和疾病防控提供科学依据。
病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50
病毒教的几个观念：PFU MOI TCID50之阳早格格创做PFU:plaque forming unit，空斑产死单位.熏染性滴度的单位普遍表示为PFU/ml.由于测定pfu往往沉复性较好，果此近些年许多钻研又启初采与TCID50要领去估计病毒的熏染单位.果此修议也可使用TCID50法.MOI :multiplicity of infection，熏染复数.保守的MOI观念起源于噬菌体熏染细菌的钻研.其含意是熏染时噬菌体与细菌的数量比值，也便是仄衡每个细菌熏染噬菌体的数量.噬菌体的数量单位为pfu.普遍认为MOI是一个比值，不单位，本去其隐含的单位是pfu number/cell.厥后MOI被一致用于病毒熏染细胞的钻研中，含意是熏染时病毒与细胞数量的比值.然而，由于病毒的数量单位有分歧的表示办法，进而使MOI爆收了分歧的含意.能爆收细胞裂解效力的病毒比圆简单疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，果此其MOI的含意与保守的观念相共.保守意思上的MOI的测定，其本理是鉴于病毒熏染细胞是一种随机事变，按照Poisson分散顺序，可估计出熏染一定比率的培植细胞所需的熏染复数（MOI）.其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 大概m = -InP（0）.其中：P 为被熏染细胞的百分率P(0)为已被熏染细胞的百分率m为MOI 值比圆，如果要熏染培植皿中99%的培植细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell.TCID50 Protocol：1：造备96孔板单层细胞2：将病毒干系列密释，横背交种单层细胞板，每密释度沉复3孔3：每日瞅察细胞病变，记录下于50战矮于50％病变孔的病毒密释度，4：估计比距，赢得TCID50估计比距：（下于50％的病变率－50％）/（下于50％病变率－小于50％病变率）＝比距；比距与交近50%病变率的病毒的密释度的指数相加，便赢得了指数.比圆：比色估计大概者隐微镜瞅察病毒的TCID50正在10的背7战8次圆之间，那么，指数－8与比距相加，赢得的新的指数，便是TCID50的指数，TCID50=10的-7.频频圆TCID50与 PFU换算: PFUs＝0.7×TCID50的滴度。
TCID50-MOI-PFU意义及其换算
Multiplicity of infection (MOI)The multiplicity of infection (abbreviated MOI) is the average number of phage per bacterium. The MOI is determined by simply dividing the number of phage added (ml added x PFU/ml) by the number of bacteria added (ml added x cells/ml). The average number of phage per bacterium in the population could be 0.1, 1, 2, 10, etc, depending upon how you setup the experiment.Although the MOI tells you the average number of phage per bacterium, the actual number of phage that infect any given bacterial cell is a statistical function. For example, if the MOI is 1, some cells will get infected with one phage but some cells may be infected with 0 phage and other cells infected with two phage. The proportion of cells in a population infected by a specific number of phage (n) can be calculatedfrom the Poisson distribution.PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。
病毒感染力的滴定
二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形
成的局限性病灶。
原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感
细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
将培养板臵37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，
与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红
DMEM混合，注入细胞培养板中。
室温放臵直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放臵几
分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
病毒学的几个概念：PFUMOITCID50之欧阳数创编
病毒学的几个概念：PFU MOITCID50PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。
感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
MOI :multiplicity of infection，感染复数。
传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP （0）。
其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
TCID50 Protocol：1：制备96孔板单层细胞2：将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔3：每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，4：计算比距，获得TCID50计算比距：（高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距；比距与接近50%病变率的病毒的稀释度的指数相加，就获得了指数。
病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50
病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50之老阳三干创作PFU:plaque forming unit,空斑形成单元.感染性滴度的单元一般暗示为PFU/ml.由于测定pfu往往重复性较差,因此近些年许多研究又开始采纳TCID50方法来计算病毒的感染单元.因此建议也可使用TCID50法.MOI :multiplicity of infection,感染复数.传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究.其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量.噬菌体的数量单元为pfu.一般认为MOI是一个比值,没有单元,其实其隐含的单元是pfu number/cell.后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值.然而,由于病毒的数量单元有分歧的暗示方式,从而使MOI发生了分歧的含义.能发生细胞裂解效应的病毒例如纯真疱疹病毒等习惯上仍用pfu 暗示病毒数量,因此其MOI的含义与传统的概念相同.传统意义上的MOI的测定,其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件,遵循Poisson分布规律,可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）.其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP （0）.其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如,如果要感染培养皿中99%的培养细胞,则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell.TCID50 Protocol：1：制备96孔板单层细胞2：将病毒做系列稀释,横向接种单层细胞板,每稀释度重复3孔3：每日观察细胞病变,记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度,4：计算比距,获得TCID50计算比距：（高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距；比距与接近50%病变率的病毒的稀释度的指数相加,就获得了指数.比如：比色计算或者显微镜观察病毒的TCID50在10的负7和8次方之间,那么,指数－8与比距相加,获得的新的指数,就是TCID50的指数,TCID50=10的-7.几次方TCID50与 PFU换算: PFUs＝0.7×TCID50的滴度。
病毒TCID50测定
病毒TCID50测定之阳早格格创做收配步调(1) 准备细胞与出一齐细胞培植板，每个孔约莫传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培植液正佳传一齐96孔板，要传匀）.每个孔的细胞铺成单层约莫60％歉度即可交种病毒（下午传佳板第二天早上便能用）.细胞对付照采用16个孔即可.滴定与对付照不妨正在一齐培植板上举止，收配中注意不要窜孔.也不妨分别正在分歧的细胞培植板上举止，然而要包管真验条件普遍.(2) 密释待测病毒液.A法为参照书籍上尺度的收配要领B法参照书籍将液体量缩小后的截止病毒密释液根据是可需要胰酶去采用符合的液体，无论哪种皆无血浑.A背每收试管中加进释液.背1号试管中加进0.2ml病毒，依次10倍系列密释至相宜浓度，末尾一收试管.B正在EP管中用无血浑的孵育液10倍倍比密释病毒本液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大概的滴度决定密释的倍数.尾次滴定不妨多密释几个滴度.根据交种的孔数密释病毒，惯例每个密释度交种4孔，则每个密释度配500µl，即10-1为50µl加进450µl的孵育液中；如每个密释度交种8个孔，则各配造1ml，即10-1为100µl 加进900µl孵育液中.若交种8个孔，则相映减少液体量.上述的配液本去不是牢固稳定的，不妨根据交种的量自止安排. 【！此步收配注意事项：1）修议每个密释度交种8个孔，若要统计分解则还要减少至16个孔.2）病毒密释历程中一定将病毒液与孵育液充分混匀.2）此历程中需要使用加样器战tip头.使用前用75%乙醇揩拭加样器，并用紫中线映照20min，保证无菌.使用新下压的tip 头，中包拆一定正在超洁台（大概仄安柜中挨启）.】(3) 交种与细胞培植板，用多讲加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培植液，吸与孵育液加正在每孔中再沉沉吹挨一次，而后吸出孵育液（此步手段是去除血浑，果为血浑能搞扰病毒的吸附）.将密释佳的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据瞅察的习惯，普遍从左到左，从上到下，从下密释度到矮密释度（10-1，10-2 ）到本液加样.【切记：树立仄常的细胞对付照.屡屡真验要沉复4次，估计尺度好.】37℃CO2培植箱中孵育1h，与出培植板吸去病毒液（从矮浓度背下浓度吸与可预防窜孔），加进保护液200µl继承正在37℃ CO2培植箱中培植.(4) 培植将培植板搁置于CO2培植箱.培植温度，培植天.(5) 测定截止与出培植板，隐微镜下瞅察细胞病变.估计要领1) Spearman-Karber 法LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）X0 = 局部病变最矮密释度对付数d = 密释果数对付数N1 = 每个密释度所种的孔数R1 = 病变孔数∑ = 积战2) Reed-Muench法瞅察CPE,找出能引起对付合细胞瓶大概管熏染的病毒密释倍数，按估计出该病毒液的TCID50TCID50 是指构造培植物（细胞）对付合致死计量.它有几个本量咱们必须明黑：1）它表示的是计量，不是浓度； 2）它是一个单位；3）它的值等于1，本量上问它的值等于几是一个不意义的问题，便像问km的值等于几一般，如果非要道出的的值等于几，那咱们只可道它的值正在所有情况下皆等于1.明黑那三个本量对付于明黑TCID50非常要害，然而是那三个本量时常被误解，所以引导对付TCID50的明黑出现偏偏好.最先咱们去瞅一下那个表示法的意义：病毒浓度为它表示的是每个TCID50的病毒，那战氯化钠的浓度为个mol的氯化钠是一般的讲理.时常不妨听到人道尔的病毒的TCID50是10^xx.那个道法是不科教的，该当道尔那个溶液里含有几个TCID50的病毒大概者道尔那个溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.明黑了TCID50的观念之后，咱们再去瞅瞅TCID50是怎么样估计的？请瞅例子：每个所加液体的体积是0.08ml.图中给出的估计要领是有问题的，请先忽略不瞅.从图中咱们不妨知讲对付合致死的密释度肯定是介于10^-6到10^－7之间，肯定不妨表示成10^-6.xx.那么那个.xx到到底是几呢？那本量上是一个线性插值的问题.供解睹下图：PD/[log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)]=[(%next above 50%)-50%]/[(%next above 50%)-(%next below 50%)]＊注意：如果您的病毒是以3倍3倍天密释那么上头那个公式的log便该当是以3为底的log，其余密释度与此相类似.正在本例子中PD/[(-6)-(-7)]=(80%-50%)/(80%-0%)log(50％的致死的密释度供解得到50％的致死的密释度为根据TCID50的定义，便把那个密释度所含的病毒的量定义为1个TCID50.正在本例中即定义把病毒密释到为1个TCID50.交下去咱们便不妨根据那个定义去供本液的病毒溶度.常常供解每ml含有几个TCID50的病毒.咱们先要去供解那个问题：已知把病毒密释到为1个TCID50，那么病毒本液曲交与个TCID50.很隐然个TCID50.再供解1ml有几个TCID50便简朴了：设1ml那样的病毒本液便有x个TCID50x=10^6.375/0.08=2.9*10^8所以每ml那样的病毒本液有2.9＊10^8个TCID50，即该病毒本液的溶度为2.9*10^8TCID50/ml[如果对付于上头尔道的“很隐然“您一时隐然不起去的话，尔不妨助您举那样的一个例子：您把溶度已知的DNA溶液密释100倍(即密释到10^-2密释度测0D值截止创造那释液含有1个ug的DNA，那么很隐然不妨知讲如果曲交与该当含有100ug 的DNA，该DNA 溶液的溶度为100ug/0.080ml=1250ug/ml.如果您还很隐然不起去的话，修议您不要进止战理工科相闭的处事，您可去当总统什么的，千万别当财务部部少！]证明：咱们已经证据，TCID50法测到的滴度d=log10值比尺度空斑法下0.7.将TCID50/ml变换为PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6PFU/ml≈4×107 PFU/ml.二次沉复考查得到的滴度值应出进个log10值（100.7）.MOI 是multiplicity ofinfection的缩写，华文译为熏染复数.保守的MOI观念起源于噬菌体熏染细菌的钻研.其含意是熏染时噬菌体与细菌的数量比值，也便是仄衡每个细菌熏染噬菌体的数量.噬菌体的数量单位为pfu.普遍认为MOI是一个比值，不单位，本去其隐含的单位是pfu number/cell。
病毒TCID50测定
病毒TCID50 测定操作步骤（1）准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000〜10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加 10ml 培养液正好传一块96 孔板，要传匀）。
每个孔的细胞铺成单层大约60 ％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16 个孔即可。
滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。
也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
（2）稀释待测病毒液。
A 法为参考书上标准的操作方法B 法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A 向每支试管中加入 1.8ml 病毒稀释液。
向 1 号试管中加入 0.2ml 病毒，依次 10 倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液（10-1 , 10- 2…10-10等），根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。
首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500口 l，即10-1 为50 口1加入450口1的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为 100口1加入900^1孵育液中。
若接种8个孔，则相应增加液体量。
上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种 8个孔，若要统计分析则还要增加至 16 个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
2）此过程中需要使用加样器和tip头。
使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射 20min ，确保无菌。
使用新高压的 tip 头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。
】（3）接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去 96 孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
TCID50概念方法资料
山东畜牧兽医职业学院动物微生物及免疫教案标记★的内容为重点，标记◎的内容为难点。
第三节沉淀试验一、沉淀试验的概念沉淀试验：可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电解质存在下, 经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitatio n reaction test ）。
参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。
二、沉淀试验的类型（一）环状沉淀试验（ringprecipitation test ）用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定。
（二）琼脂凝胶扩散试验简称琼扩，1. 概念：1%琼脂凝胶的孔径约为85nm 因为凝胶网孔中充满水分，小于孔径的抗原或抗体分子可在琼脂凝胶中自由扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例适当处相遇时，即可发生沉淀反应，因形成的抗原抗体复合物为大于 凝胶孔径的颗粒，不能在凝胶中再扩散，就在凝胶中形成肉眼可见的沉淀带， 称 此试验为琼脂凝胶扩散试验。
2. 琼脂扩散分四类（图11-3）:单向单扩散单向双扩散 双向单扩散双向双扩散。
（1）双向单扩散 又称辐射扩散应用：传染病的诊断，如鸡马 立克氏病的诊断。
（2）双向双扩散应用最广泛应用：细菌、病毒的鉴定和传染 病的诊断。
如检测口蹄疫、马立克氏病、禽流感、传染性法 氏囊病的琼脂扩散方法。
双扩散用于检测抗体（图11-4）琼脂扩散四种基本类型（据陆承双扩散用于检测抗体（据陆承平）优点：在琼脂扩散的基础上，提高了反应速度、反应灵敏度和分辨率。
在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。
平）（三）免疫电泳的免疫检测技术。
免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合1.对流免疫电泳（图11-5）是将双向双扩散与电泳技术相结合的免疫检测技术。
用于多种传染病的快速诊断。
如口蹄疫、猪传染性水疱病等病毒病的诊断。
tcid50法
tcid50法TCID50法是一种常用的病毒滴度测定方法，用于评估病毒溶液中的活性病毒数量。
TCID50是指病毒的50%组织细胞传染性滴度。
病毒滴度是指病毒溶液中含有多少活性病毒颗粒的浓度。
确定病毒滴度的目的是为了量化病毒溶液中的活性病毒数量，从而为研究人员提供准确的病毒浓度信息，用于病毒研究、疫苗制备和药物筛选等领域。
TCID50法是通过对细胞培养物进行稀释接种，然后观察细胞的病毒感染情况来测定病毒滴度的一种方法。
具体操作过程如下：将细胞培养物均匀地分配到培养皿中。
然后，将病毒溶液进行一系列的稀释，每次稀释一倍，得到一系列的稀释液。
接下来，将每个稀释液滴加到培养皿中的不同孔上。
然后，将培养皿放入恒温培养箱中，让病毒与细胞进行接种。
接种一段时间后，观察培养皿中细胞的感染情况。
可以通过显微镜观察细胞形态的变化，或者通过染色等方法来观察病毒感染的细胞。
根据感染细胞的数量和稀释液的稀释倍数，计算出病毒的TCID50值。
通常，TCID50值是通过统计病毒感染和未感染细胞的比例来计算的。
TCID50值越高，表示病毒的传染性越低；而TCID50值越低，表示病毒的传染性越高。
因此，通过TCID50值可以评估病毒的感染能力和传播能力。
TCID50法具有操作简单、结果可靠的优点，因此被广泛应用于病毒研究和疫苗制备过程中。
通过测定病毒的TCID50值，可以帮助研究人员评估病毒的传播能力和感染能力，从而指导病毒研究和疫苗制备的实验设计。
TCID50法是一种常用的病毒滴度测定方法，通过对细胞培养物进行稀释接种，然后观察细胞的病毒感染情况来测定病毒滴度。
通过测定病毒的TCID50值，可以评估病毒的传播能力和感染能力，为病毒研究和疫苗制备提供准确的病毒浓度信息。
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定（TCID50的测定）概念：半数感染量（median infective dose， ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。
一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
实例1鸡新城疫活疫苗（一）培养病毒将鸡新城疫病毒（la sota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。
TCID50和PFU的换算公式
1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50
病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50之阿布丰王创作PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。
感染性滴度的单位一般暗示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采取TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
MOI :multiplicity of infection，感染复数。
传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有分歧的暗示方式，从而使MOI发生了分歧的含义。
能发生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu暗示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
TCID50 Protocol：1：制备96孔板单层细胞2：将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔3：每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，4：计算比距，获得TCID50计算比距：（高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距；比距与接近50%病变率的病毒的稀释度的指数相加，就获得了指数。
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定（TCID50的测定）概念：半数感染量（median infective dose， ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。
一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture inf ective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10 -10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数（-1）D：稀释度对数之间的差（lg10-1-lg10-2=1）S：阳性孔比率总和（1+1+0.875+0.375+0.125=3.375）lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
TCID50和PFU的换算公式
TCID50和PFU的换算公式1、PFU:plaqueformingunit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
2、MOI:multiplicityofinfection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poion分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P=1-P(0),P(0)=e-m或m=-InP（0）。
其中：P为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0)=1%=0.01 m=-In(0.01)=4.6pfu/cell。
(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
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山东畜牧兽医职业学院动物微生物及免疫教案标记★的内容为重点，标记◎的内容为难点。
第三节沉淀试验一、沉淀试验的概念沉淀试验：可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test）。
参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。
二、沉淀试验的类型（一）环状沉淀试验（ring precipitation test）用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定。
（二）琼脂凝胶扩散试验简称琼扩，1.概念：1%琼脂凝胶的孔径约为85nm，因为凝胶网孔中充满水分，小于孔径的抗原或抗体分子可在琼脂凝胶中自由扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例适当处相遇时，即可发生沉淀反应，因形成的抗原抗体复合物为大于凝胶孔径的颗粒，不能在凝胶中再扩散，就在凝胶中形成肉眼可见的沉淀带，称此试验为琼脂凝胶扩散试验。
2.琼脂扩散分四类(图11-3)：单向单扩散单向双扩散双向单扩散双向双扩散。
（1）双向单扩散又称辐射扩散应用：传染病的诊断，如鸡马立克氏病的诊断。
（2）双向双扩散应用最广泛应用：细菌、病毒的鉴定和传染病的诊断。
如检测口蹄疫、马立克氏病、禽流感、传染性法氏囊病的琼脂扩散方法。
双扩散用于检测抗体(图11-4)琼脂扩散四种基本类型（据陆承平）双扩散用于检测抗体（据陆承平）（三）免疫电泳免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。
优点：在琼脂扩散的基础上，提高了反应速度、反应灵敏度和分辨率。
在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。
1.对流免疫电泳(图11-5)是将双向双扩散与电泳技术相结合的免疫检测技术。
用于多种传染病的快速诊断。
如口蹄疫、猪传染性水疱病等病毒病的诊断。
2.火箭免疫电泳(图11-6)是将辐射扩散与电泳技术相结合的一项检测技术，简称火箭电泳。
将pH8.2～8.6的巴比妥缓冲液琼脂融化后，冷至56℃左右，加入一定量的已知抗血清，浇成含有抗体的琼脂凝胶板。
在板的负极端打一列孔，孔径3mm，孔距8mm，滴加待检抗原和已知抗原，电泳2～10h。
电泳时，抗原在含抗血清的凝胶板中向正极迁移，其前锋与抗体接触，形成火箭状沉淀弧，随抗原继续向前移动，此火箭状锋亦不断向前推移，原来的沉淀弧由于抗原过量而重新溶解。
最后抗原抗体达到平衡时，即形成稳定的火箭状沉淀弧（图11-6）。
在试验中由于抗体浓度保持不变，因而火箭沉淀弧的高度与抗原浓度呈正比，本法多用于检测抗原的量（用已知浓度抗原作对比）。
第四节补体结合试验一、基本原理（图11-7）本试验包括两个系统共五种成分：检测系统（溶菌系统）：即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；指示系统（溶血系统）：包括绵羊红细胞、溶血素和补体。
二、补体结合试验的基本过程及应用基本过程：第一步为反应系统作用阶段第二步是溶血系统作用阶段观察结果：最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合，结果是阳性；最终表现是溶血，说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，结果是阴性。
应用：1.诊断传染病，如结核、副结核、鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、锥虫病等。
2.鉴定病原体，如对流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。
第五节中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。
中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。
中和试验可在体内进行也可在体外进行。
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。
常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。
体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。
根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。
根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。
毒素和抗毒素也可进行中和试验。
其方法与病毒的中和试验基本相同。
一、终点法中和试验l终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。
有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。
(一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。
1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD50)作为毒价单位，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。
以感染发病作为指标的，可用半数感染量(ID50)。
用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID50)。
在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
2.病毒毒价测定将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3……，选择4～6个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组3～6只(个、孔)。
接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。
根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。
然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。
以TCID50测定为例说明如下：按Karber法计算，其公式为lgTCID50=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组死亡（感染）数/试验数相加。
若以测定某种病毒的TCID50为例，病毒作10-4～10-7稀释，记录其出现细胞病变（CPE）的情况（表11-1）。
则L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16lgTCID50=(-4)+(-1)×(2.16-0.5)=-5.66。
TCID50=10-5.66，0.1ml。
TCID50为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.66（1/105.66）时，每孔细胞接种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。
而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少TCID50或（LD50等）表示。
如上述病毒的毒价为105.66TCID50/0.1ml，即106.66TCID50/ml。
表11-1 病毒毒价滴定(接种剂量0.1ml)3.正式试验将病毒原液稀释成每一单位剂量含200LD50(或EID50、TCID50)，与等量递进稀释的待检血清混合，置37℃感作1h。
每一稀释度接种3～6只（个、管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组动物的存活数和死亡数，同样按Reed-Muench法或Karber法计算其半数保护量（PD50），即该血清的中和价。
(二)固定血清稀释病毒法将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列无菌试管，第一列加等量正常血清(对照组)，第二列加等量待检血清(中和组)；混合后置37℃感作1h，每一稀释度接种3～6只试验动物(或鸡胚、组织细胞)，记录每组动物死亡数、累积死亡数和累积存活数（表11-2），按Karber法计算LD50，然后计算中和指数。
中和指数=中和组LD50/对照组LD50。
按表11-3的结果：中和指数=10-2.2/10-5.5=103.3，查3.3的反对数为1995，即103.3=1995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1994倍。
通常待检血清的中和指数大于50者即可判为阳性，10～40为可疑，小于10为阴性。
表11-2 固定血清稀释病毒法中和指数测定举例二、空斑减数试验（Plague reduction test）空斑或蚀斑是指把病毒接种于单层细胞，经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态。
空斑减数试验是应用空斑技术，使空斑数减少50%的血清稀释度为该血清的中和效价。
试验时，将已知空斑形成单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加等量递进稀释的血清，37℃感作1h。
每一稀释度至少接种3个已形成单层细胞的培养瓶，每瓶0.2～0.5ml，37℃感作1h，使病毒与血清充分作用，然后加入在44℃水浴预温的营养琼脂（在0.5%水解乳蛋白或Eagles液中，加2%犊牛血清、1.5%琼脂及0.1%中性红3.3ml）10ml，平放培养箱中。
同时用稀释的病凝固后，将细胞面朝上放入无灯光照射的37℃ CO2毒加等量Hanks液同样处理作为病毒对照。
数天后分别计算空斑数，用Reed-muench法或Karber法计算血清的中和滴度。
第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术酶标抗体技术同位素标记抗体技术优点：敏感性和特异性大大超过常规血清学方法一、荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）用荧光色素标记（一）原理将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合（二）荧光色素可用于标记的荧光色素有：]异硫氰酸荧光黄(FITC)：应用最广，呈现明亮的黄绿色荧光，荧光抗体四乙基罗丹明(RB 200)四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。
细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，制成涂片或压印片。
感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。
也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。
标本固定的目的：一是防止被检材料从玻片上脱落；二是消除抑制抗原抗体反应的因素最常用的固定剂是丙酮和95%的乙醇固定后用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
2．染色方法荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。
（1）直接法（图11-8）荧光色素标记的抗体染色优点：简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点：敏感性偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。