盐酸替罗非班原料药细菌内毒素检查法的建立

盐酸替罗非班原料药细菌内毒素检查法的建立

发表时间：2020-01-02T09:24:42.947Z 来源：《中国医学人文》2019年12期作者：刘晓云1，朱子微1，潘迎锋1

[导读] 目的：建立盐酸替罗非班原料细菌内毒素的检查方法。

摘要目的：建立盐酸替罗非班原料细菌内毒素的检查方法。方法：依据2015年版《中国药典》“细菌内毒素检查法”项下凝胶法的要求，通过干扰试验确定样品最大无干扰浓度，并进行方法学验证。结果：样品浓度在0.05mg/ml或以下时对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用。结论：所建立的方法可用于盐酸替罗非班原料的细菌内毒素检查。

关键词盐酸替罗非班；细菌内毒素检查，凝胶法；干扰试验

Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban Hydrochloride

LIU xiaoyun（ChiataiQingchunbao Pharmaceutical Co..Ltd.，Zhejiang Hangzhou 310023,China）

ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban Hydrochloride .METHODS：According to the appendix of the gel method under“bacterial endotoxin test method”in Chinese Pharmacopiea（2015 edition），the maximal non-interference concentrations of samples were determined by interference test ,and then methodology validation was conducted.RESULTS:The agglutination of LAL with bacterial endotoxin had no interference when the sample was diluted to 0.05mg/ml or below. CONCLUSIONS: The established method can be used to detect the bacterial endotoxin of Tirofiban Hydrochloride.

KEYWORDS Tirofiban Hydrochloride; Bacterial endotoxin test; Gel method; interference test

抗血小板治疗在冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗中起着十分重要的作用。盐酸替罗非班是一种非肽类的血小板糖蛋白Ⅱa/Ⅲb受体（该受体是与血小板聚集过程有关的主要血小板表面受体）的可逆性拮抗药，可阻止纤维蛋白原与糖蛋白Ⅱa/Ⅲb受体结合，从而阻断血小板的交联及血小板的聚集。盐酸替罗非班可抑制二磷酸腺甘诱导的血小板聚集及延长出血时间，可强效抑制血小板功能，作用显著，特异性强[1]。为提高盐酸替罗非班原料药的质量控制水平，笔者依据2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”项下的凝胶法的要求[2]，并参考相关文献对盐酸替罗非班原料药的细菌内毒素检查方法进行了研究。

1仪器与试药

1.1仪器振荡器，ZH-2 BLENDER；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9146A型，上海精宏实验设备有限公司；细菌内毒素测定仪，BET-72，天津天大天发科技有限公司；

1.2药品与试剂盐酸替罗非班原料批号：1101-S170301，1101-L170301，1107-L170401，1107-L170402，1107-L170501，浙江浙邦制药有限公司。细菌内毒素工作标准品：10EU\支，批号：1609090，湛江安度斯生物有限公司。细菌内毒素检查用水：5ml/支，批号：1701190，湛江安度斯生物有限公司。鲎试剂：1、灵敏度0.25EU/ml，规格0.5ml/支，批号：1609281，湛江安度斯生物有限公司；2、灵敏度

0.125EU/ml，规格0.5ml/支，批号：1602031，湛江安度斯生物有限公司；3、灵敏度0.25EU/ml，规格0.5ml/支，批号：16070312，福州新北生化工业有限公司；4、灵敏度0.125EU/ml，规格0.5ml/支，批号：16070912，福州新北生化工业有限公司。

2方法与结果

2.1内毒素限值的确定（L）根据盐酸替罗非班注射液规定的限值1EU/ml，规格5mg/100ml，计算原料的L=1EU/ml*100ml/5mg=20EU/mg，根据从严原则，我们规定盐酸替罗非班原料的细菌内毒素限值为10EU/mg。

2.2鲎试剂灵敏度复核实验[3-6] 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），用BET水把CSE稀释成2λ，λ，0.5λ，0.25λ的系列浓度，按2015年版《中国药典》（四部）通则1143方法操作，以BET水做2支阴性对照管（NC），对2个厂家生产的TAL进行复核。

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1(∑X/4)，式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。结果见表1。

4批鲎试剂灵敏度均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ），均符合规定，可以用于实验。

2.3干扰初筛试验根据最大有效稀释倍数MVD=CL/λ,该供试品为原料，MVD取1，对应于灵敏度（λ）0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU\ml的TAL，盐酸替罗非班的最低稀释浓度分别为0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml。因此用BET水将一批供试品（批号：1101-S170301）分别稀释成0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml5个浓度，供干扰试验初筛使用。

取灵敏度为0.25EU/ml的TAL（安度斯）24管，其中10支做供试品阴性对照（NPC）系列反应，分别加0.1ml 0.05、0.025、0.0125、

0.006、0.003mg/ml各浓度的供试品溶液，每一浓度供试品2支反应管；另10支做供试品阳性对照（PPC）系列反应，即加入含2λ

（0.5EU/ml）的内毒素标准溶液的浓度为0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml的供试品溶液0.1ml，每一浓度供试品2支反应管，选出对