基因定点突变技术.

PCR介导的定点突变的优势
1、突变体回收率高，有时不需要进行突变体筛选；
2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突
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变； 3、可以在同一试管中完成所有反应； 4、快速简便，无需再噬菌体M13载体上进行分子克隆。
三、基因定点突变应用
近年来，由于突变技术使得人们可以按照自 己的意愿改造基因或蛋白质的产物，从而取得改 变后的产物，使其造福于人类。因此突变技术已 广泛应用在各个领域，具有着广阔的应用前景。 分为： 1、突变技术在蛋白质工程中的应用 2、ＤＮＡ缺失改造
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡 核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变 法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变 是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核 苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该 法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介 导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物， 在聚合酶的作用下启动对ＤＮＡ分子的复制， 该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能 与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变 效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导 的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另 一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂， 且易发生其他突变；
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
在酶工业方面：
一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不 显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响 酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、 极端ｐＨ、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于 这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的 结构和功能。
在医药方面：
通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗 生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非 常重要的指导意义。
２、ＤＮＡ缺失改造
心钠素（ＡＮＰ）和干扰素（ＩＦＮ）在临床上 有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在 克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序 列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的 差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物一样，人 们便采用寡核苷酸指导的定点突变技术，成功地对这 些多余的核苷酸进行了缺失改造，以期得到正确的产 物。
基因定点突变技术
目录
一、定点突变简介
二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用
四、展望
一、定点突变简介
定点突变（site-directed mutagenesis） 技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中 取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以 有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基 次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理， 也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关 系。
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
在农业方面：
利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结 构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用 突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新 的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机 磷污染 民用杀虫剂。
将待突变的目的基因
插入M13噬菌体载体 上，制备单链DNA
将合成的寡核酸片段
与单链模板退火，在 DNA聚合酶的作用下 合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠 杆菌，获得突变基因
突变体的筛选：寡核
酸探针杂交筛选法
3、重叠延伸介导的定点诱变
首先将模板DNA分别分别与 引物对1（正向诱变引物FM和 反向引物R2）和2（正向引物 F2和反向诱变引物RM）退火， 通过PCR1和2反应扩增出两种 靶基因片段。FMR2和RMF2片段 在重叠区发生退火，用DNA聚 合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。最后， 用引物F2和R2扩增出带有突变 位点的全长DNA片段（PCR4)。
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。