定点诱变技术解析
1.3蛋白质工程 教案(苏教版选修3)
第三节蛋白质工程●课标要求简述蛋白质工程。
●课标解读1．简述蛋白质工程的概念和原理。
2．说明蛋白质工程和基因工程的区别与联系。
3．举例说明蛋白质工程的应用和发展。
●教学地位蛋白质工程是基因工程的延伸，又称为第二代基因工程，是按照人们的需要，利用基因工程的原理对蛋白质进行改造。
目前蛋白质工程还有许多理论和技术问题等待解决，成功的实例还不多，但发展前景广阔。
在高考中考到的次数还不多，常在考查基因工程的非选择题中有一问涉及蛋白质工程。
●教法指导1．结合过程图，让学生理解蛋白质工程的基本原理。
2．结合具体的应用实例，让学生理解蛋白质工程的应用。
●新课导入建议玉米的营养价值不如小麦，原因是玉米中必需氨基酸赖氨酸的含量比较低。
玉米中赖氨酸含量低的原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性受到赖氨酸浓度的影响较大，当赖氨酸浓度达到一定量时，会抑制两种酶的活性。
所以玉米中赖氨酸的含量很难提高，如果我们将天冬氨酸激酶第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶的第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米种子中的赖氨酸含量提高2倍，那么怎样对这两种酶进行改造呢？这就要依靠蛋白质工程。
●教学流程设计课前自主探究：阅读教材P30～35有关知识，填充【课前自主导学】空白，完成思考交流1、2。
⇒步骤1：课程导入：建议用【新课导入建议】方法导入课题。
⇒步骤2：尝试作答【课前自主导学】部分的【正误判断】，检查自学效果。
⇒步骤3：教师结合教材P30图1－17和教材P31图1－18让学生理解蛋白质工程的原理，通过【课堂互动探究】探究1归纳总结，通过例1强化。
⇓步骤6：诵读【结论语句】，尝试构建最优知识网络图解，互评后参看【本课知识小结】的网络构建。
课下完成【当堂双基达标】。
⇐步骤5：通过教材中的实例让学生认识蛋白质工程的应用，认识蛋白质工程的意义。
⇐步骤4：引导学生讨论蛋白质工程和基因工程的区别与联系，通过【课堂互动探究】探究2的表格进行比较。
热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)
得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术 （1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不 能互补的突变位点，而这两条引物有部 分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引 物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完 整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到 含有突变位点的DNA片段。
①首先人工合成一段含有特定突变位
点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，
该片段的其他部分可以与目的基因互补
配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的
基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生
而来）进行杂交；
M13噬菌体是一种丝状噬菌体， 内有一个环状单链DNA分子
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作
用下分别进行DNA链的合成和连接反应，
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基构因建，改有良的基质因粒组为质空粒白时质破粒坏，了将含上 述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培L养ac一Z基段因时(间因后)，，含再该将质菌粒液的涂大布肠在含 氨苄青霉素和__β__-_半__乳__糖__苷___的平板上。一段时间后杆，菌在不培能养分基解上β出-现半白乳色糖和苷蓝产色生两蓝种 菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是__色__物__质__（_。变），菌落为白色（果）
二轮微专题— 基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
• 【情境原理】 • 1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用作者：胡文斌朱云波来源：《中学生物学》2013年第08期在蛋白质工程中对蛋白质结构进行的设计改造，最终还必须通过基因来完成。
设计改造后的蛋白质在自然界生物中不存在相应的基因，往往需要通过人工化学合成或基因修饰获得，其中基因修饰的主要方法就是基因定点诱变。
如在高中生物人教版选修3教科书“蛋白质工程的崛起”这一节中谈到：“将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
”这个实例中，改造后的蛋白质基因与原始基因只有一个碱基对的差异，其所用的方法就是基因定点诱变。
但是，基因突变往往是不定向的，是随机的，研究者如何让基因按照人的意愿进行定向突变呢？为什么没有用化学合成法合成基因呢？化学合成法有什么弊端吗？下面就这些问题作简要分析和阐述。
1 基因定点诱变的原理和方法基因定点诱变技术是蛋白质工程研究中的一种重要方法，其实质是利用化学合成寡核苷酸和基因重组技术相结合的方法，按照预定设计，对已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。
最具代表性的定点诱变方法有以下三种。
1.1 寡核苷酸介导的定点诱变利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突变，而不受限制酶切点的限制（图1）。
如果希望改变某个DNA的某个特定碱基，可以先合成一条突变碱基位于中间的寡核苷酸，一般长度约15～20 bp。
这条寡核苷酸链除了突变碱基外，其余的序列与野生型DNA分子中的相应序列完全一致。
然后将合成的寡核苷酸与由单链噬菌体做载体所携带的DNA克隆互补链混合，进行分子杂交。
这段配对的寡核苷酸可以做为引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互补链，再用DNA连接酶连接起来。
将此双链DNA导入大肠杆菌中，经扩增就可以得到大量可稳定遗传的的突变DNA克隆。
1.2 盒式定点诱变盒式定点诱变是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
基因的定点诱变
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用
环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用[摘要] 目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。
方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。
结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。
结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。
[关键词] 环状定点突变;聚合酶链反应;质粒;人促甲状腺激素受体采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibodies,TRAb)时,需要应用表达人促甲状腺激素受体(human thyroid stimulating hormone receptor,hTSHR)的细胞株。
国内目前尚没有此类细胞株供应,鉴于此,本课题组尝试进行了这方面的研究,前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序发现目的基因hTSHR cDNA序列上第256位碱基发生了突变,因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变,以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。
1 材料与方法1.1 材料Muta-directTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司,DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pcDNA3.1-hTSHR(-256 C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建,限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品,胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,其余为国产分析纯。
2023届高考二轮总复习试题 专题8 生物技术与工程 命题篇强化练10(专项命题一)
命题篇强化练10(专项命题一)1.[PCR技术及其应用](2022湖北黄冈一模)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。
某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。
下列说法错误的是()注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为GC.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR2.[PCR技术及其应用](2022天津一模)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。
如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。
有关叙述不正确的是()A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/23.[PCR技术及其应用](2022北京一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。
在雌激素的诱导下,细胞内信号转导分子可以与kissl基因启动子的特定区域结合,激活kissl基因的转录。
研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。
基因工程第七章DNA定点诱变
• 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果
错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
• 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长
度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体 之间的热稳定性差异足够大。
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
转化子诱变法
Synthesize second strand
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli mutS to propagate plasmids
ATG ATG
ATG ATG
BamHI
ATG
BamHI
PCR ATG
ATG
EcoRI
PCR
ATG
EcoRI
重叠延伸
BamHI
ATG
PCR EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III 5‘ 3‘
5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
DNA ligase
U
U
U
U
U
2．原理
Insert target DNA
转化 E.coli CJ236
U
U
U U
U
U
Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
UU
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
14
一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
32
33
? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
34
四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
高中生物学选择性必修3课时作业15
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
解析：基因工程和蛋白质工程均是对基因进行操作，基因工程合成的是 天然存在的蛋白质，而蛋白质工程可以合成非天然存在的蛋白质，A 错误； 可以通过对 X 蛋白基因进行修饰或人工合成获得 X1 蛋白基因，B 正确；蛋 白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，其过程中也需 要酶和载体作为工具，C 错误；细胞内合成 X1 蛋白与 X 蛋白的过程中，遗 传信息的流向是相同的，D 错误。
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
11．(2021 江苏扬州市高二期末)蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又 称第二代基因工程。下图示意蛋白质工程流程。下列有关叙述错误的是( A )
A．蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白改造 C．①②过程为转录和翻译 D．蛋白质工程是从④开始的
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
解析：细胞中蛋白质糖基化是一种翻译后修饰，主要发生在内质网中， A 错误；糖基化对蛋白质的空间结构有影响，进而影响蛋白质的溶解度、稳 定性、活性等特性，B 正确；基因控制蛋白质的合成，据此可推测蛋白质糖 基化工程可通过基因工程改变糖基化途径中有关酶实现糖基化途径的改变， C 正确；进行合适的糖基化修饰可改变蛋白质的空间结构，进而可以提高治 疗性蛋白质的疗效，D 正确。
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
6．(2021 山东青岛二中高二期末)某团队用化学法人工合成了脑啡肽 N 端五肽(能与细胞膜上某种受体特异性结合)的编码区，使其与人干扰素基因 连接，在大肠杆菌中成功表达出一种融合蛋白，该融合蛋白抑制肿瘤细胞生 长的活性显著高于单纯的干扰素。下列叙述错误的是( B )
分子生物学 定点诱变liu
第一节
定点诱变
一、定点诱变的概念
利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入 或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基 发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。 定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。
延伸 5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.. ..3′ ……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5′ 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA…. 3′ …..T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT.. 5′
Michael Smith 1/2 of the prize Canada
四、定点诱变的常用方法
（一）M13DNA寡核苷酸诱变
基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又 以M13 和λ 为最常用。 M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb， 在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染 型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体 内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链 （dsDNA），称为复制型（replication form,RF） M13（RF- M13）。 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统 （phage display)和因定点诱变的意义
用于研究基因的结构与功能；
通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，
定点诱变名词解释 -回复
定点诱变名词解释-回复
定点诱变是一种通过分子生物学技术，以确定的方式改变特定基因或DNA 序列的方法。
这种方法通常涉及到使用PCR（聚合酶链反应）和突变引物来引入特定的突变。
在定点诱变中，研究人员可以设计一种特殊的引物，该引物与DNA模板上的目标区域互补，并且包含一个或多个突变位点。
当PCR扩增时，这些突变引物将引导DNA聚合酶合成带有突变的新DNA链。
然后可以通过克隆和其他方法将这些突变的DNA片段插入到宿主细胞中，以便进一步研究。
定点诱变可以用于许多不同的目的，包括研究基因功能、改善蛋白质性质以及创建新的生物制品等。
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。
通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。
该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。
CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。
TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。
TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。
锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。
ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。
第七章基因的定点诱变
野 生 型 DNA
H in d I I I 移走小片段
E coR I
H in d I I I E coR I
人工合成的寡核苷酸片段 退火
H in d I I I
H in d I I I
E coR I
突变体序列
E coR I
D N A连 接 酶
简 单 盒 式 取 代 诱 变
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的
寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补
Mg2+: 独立作用于每条DNA链，位点随机 Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA
产生平端 或1-2个核苷酸突出
ccc DNA DNase I, Mn2+(low concentration)
Klenow re-ligation
A digestion
作业
利用寡核苷酸进行定点诱变的方法和原 理
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。
不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
2024届高考生物二轮复习教师用书(学案) 第一篇 主题五 高考热点(五) PCR的应用
PCR的应用随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。
PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。
各种PCR技术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR 等。
在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。
1．实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。
当探针完整时，不产生荧光。
在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q 分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。
如某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。
原理如图：3．PCR定点突变——大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。
高中生物苏教版选择性必修3第三章 第三节 蛋白质工程
提示 应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造，主要原因 如下： (1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进 行了改造，而且改造过的蛋白质可能会遗传下去。如果对蛋白质直接 改造，即使改造成功，但被改造过的蛋白质分子也是无法遗传的。 (2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。
3.通过基因改造生产目标蛋白质 (1)基因的体外定向突变 ①适用对象：掌握了基本 结构信息的蛋白质。 ②类型
目的
方法
大面积的定向突变
_基__因__全__合__成__
单一或少数几个突变位点的基因定向突变 _引__物__定__点__引__入__法__
③定点诱变法的过程示意图
引物 突变
DNA聚合酶 DNA连接酶 受体细胞
4.蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过改造或合成 基因来完成，而不直接改造蛋白质的原因是 A.缺乏改造蛋白质所必需的工具酶
√B.改造基因易于操作且改造后能够遗传
C.人类对大多数蛋白质高级结构知之甚少 D.蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化，操作难度大
解析 由于基因控制蛋白质的合成，所以对蛋白质设计改造可通过对基 因进行改造或合成来完成，且改造后的基因能够遗传给子代。
2.中华鲟是地球上最古老的脊椎动物之一，被称为“活化石”。研究者试 图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的 水域环境。以下说法错误的是 A.该工程可以定向改变蛋白质分子的结构 B.改造蛋白质是通过改造基因结构来实现的 C.改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
√D.改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
别 过程 列→改造或合成可以产生新蛋 的基因导入受体细胞→
白质的相关DNA序列→合成新 目的基因及其表达产物
环状定点诱变技术在载体构建中的应用
环状定点诱变技术在载体构建中的应用作者：王斌邢体坤宋路萍杨振苹荆新蕊王亚萍黄帅张静静来源：《中国当代医药》2020年第26期[摘要]目的探讨环状定点诱变技术在目标质粒单碱基突变，酶切位点修改和片段删除中的应用。
方法设计包含目标突变，部分互补且5’端含有5～8 bp突出的引物对，环状质粒作为模板进行扩增，甲基化酶DpnI酶消化去除模板质粒。
转化DH5α感受态进行缺口修复，获得定点突变的目标质粒。
结果通过酶切和基因测序证明，环状定点诱变技术可高效用于单碱基突变、酶切位点修改和片段删除等突变。
结论环状定点诱变技术能够简便、高效、快捷地实现目标质粒的单碱基突变、酶切位点修改和片段删除，基本满足药物开发过程中载体构建的需求。
[关键词]环状定点诱变;片段删除;酶切位点;PCR扩增[中图分类号] R450 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2020）9（b）-0032-04Application of circular site-directed mutagenesis in vector constructionWANG Bin1 XING Ti-kun2 SONG Lu-ping2 YANG Zhen-ping2 JING Xin-rui2 WANG Ya-ping2 HUANG Shuai2 ZHANG Jing-jing21. Department of Quality Control， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China;2. Department of Recombinant Cell， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China[Abstract] Objective To explore the application of circular site-directed mutagenesis technology in single base mutation， restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid. Methods The primer pairs were designed including target mutation， partial complementation， and 5’ end contains 5-8 bp protruding. The circular plasmid was used as template for amplification and digested and removed by methylase enzyme DpnI. Transform DH5α for gap repair then site-directed mutation plasmid was obtained. Results Through the validation by enzyme cutting and gene sequencing， circular site-directed mutagenesis technology could be efficiently used in single base mutation， modification of enzyme site and deletion of fragment. Conclusion The circular site-directed mutagenesis technology is simple， efficient and quick to realize single base mutation，restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid， which can basically meet the needs of molecular construction in the process of drug development.[Key words] Circular site-directed mutagenesis technology; Fragment deletion; Restriction enzyme cutting site; PCR amplification定點诱变是体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列任何一个特定碱基的技术[1]。
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第三章DNA突变技术
•基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。
•根据其特点可将基因突变技术分两大类：
1.位点特异性突变定点突变
2.随机突变表型筛选
➢随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
❖降低一种dNTP的量（降至5％-10％）❖加入dITP来代替被减少的dNTP
❖缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
DNA Shuffling
❖外显子、单基因和基因家族的重组装❖随机引物延伸法
❖交错延伸法
➢定点突变
点突变——碱基删除、增补和替换
易错PCR(epPCR)
How DNA shuffling is done in the tube
❖Random fragmentation of a pool of related genes;
❖Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
❖
PCR amplification with primers of reassembled products
How DNA shuffling works
Similar mutants generated by
error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras
Generating chimeras with crossovers of large blocks
of sequences
一、单基因和基因家族的重组装
X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX
XX X
X XX X
XXX X XX X
XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best
with DNAseI fragments recombinants
Repeat for multiple cycles
一、单基因和基因家族的重组装
D N A 重组装的过程
（Jae Kwang Song等，2000）
β-葡糖苷酶耐热性的提高
(Marýa Jesu s Arrizubieta 等，2000）
耐热p-硝基苯酯酶的分子进化
(Lori Giver 等，1998）
The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573)are shown in red. Two
mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908)are
shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on
the protein surface (Val9 and Gln135)are shown in green. The rest of
the substrate binding and active site residues are shown in yellow..
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
（Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向进化（Su-Hua Huang等,2004）
定点突变的研究意义
1.对调控区进行突变
➢研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
➢检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用
➢获得突变蛋白
定点突变的类型
▪寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
▪盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
▪PCR介导的基因突变
DNA定点突变的种类➢寡聚核苷酸介导替换、插入、删除
➢盒式突变
➢PCR介导
寡聚核苷酸介导法
在dut+的E. coli中
dUTP酶
dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut-）
dUTP dUMP
dut：dUTPase突变，可导致E. coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。
在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。
但在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。
用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。
此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。
噬菌粒载体
（phagemid ）
无5‘-3’外切活性
3‘-5’外切活性低M13K07辅助感染
产生带U 的单链DNA
这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。
主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
盒式定点突变
PCR介导的基因突变
▪在基因5’和3’末端产生突变▪重叠延伸PCR
▪大引物PCR法
在基因5’和3’末端产生突变
重叠延伸法定点突变技术的原理示意图
重叠延伸PCR法小结
缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛。
同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变。
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法寡聚核苷酸
介导的突变
盒式突变PCR介导的突变
优点保真度高简单易行
突变效率高
操作简单
突变成功率高
缺点操作复杂
周期长
合成多条引物成本高
受到酶切位点的限制
后续工作复杂
TaqDNA聚合酶保真性偏低
应用产品
一步反向PCR法
Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒SBS Genetech公司的Muta-direct™Site Directed Mutagenesis Kit
Stratagen公司的QuikChange®Multi Site-Directed Mutagenesis Kit
TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit
一种简便快速的定点突变的方法
Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在1～2d内即可完成点突变过程。
DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。
Overview of the QuikChange®XL site-directed mutagenesis method.
Steps of Muta-direct™Site-Directed Mutagenesis Kit
资料表明，引入3个定点突变的效
率为60%，5个定点突变的效率为30%。
Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method
适用于插入片段长度在
1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)。