定点诱变技术解析

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基因定点突变技术

在酶工业方面：
一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、极端ｐＨ、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的结构和功能。
在医药方面：
通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非常重要的指导意义。
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明的应用前景。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利Hale Waihona Puke Baidu一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列。
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列

第七章定点诱变

制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的 DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如 M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶
2．原理 Kunkel 法过程包括： ① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。
② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的嘧啶核苷酸。 Mg2+ ：独立作用于每条 DNA 链，位点随机。
第四节嵌套缺失嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化 DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失和多组终末端相差无几的缺失体利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位, 用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动子和增强子等顺式作用元件
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物一个是用来引入突变的突变引物一个是用来选择用的

《定点诱变技术》课件

4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析，解读实验结果，得出结论，为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因修复中的应用
定点诱变技术可以实现对基因组特定位点的精准修饰，为基因修复研究提供了新思路，有望用于治疗遗传性疾病等。
定点诱变技术在农业生产领域中的应用
可以利用定点诱变技术来研发适应环境变化、产量、营养含量更高的作物品种，提高粮食产量和质量。
定点诱变技术可能会带来一系列的伦理、法律和社会问题，例如导致人们撕裂不和，社会不公等问题。
定点诱变技术未来发展的瓶颈和解决方案
目前，定点诱变技术在某些肿瘤细胞和人类胚胎细胞中并没有得到广泛应用，需要进一步研究，探索更为高效、精准、安全的定点诱变技术。
《定点诱变技术》PPT课件
本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望，以及它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术？
定点诱变技术是一种精准编辑基因的方法，可以在基因组中特定位置对基因进行修改。
为什么需要定点诱变技术？
传统的基因编辑技术往往是非特异性的，不能达到精准编辑的效果，而定点诱变技术可以避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买

基因定点突变全攻略

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也

可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点

突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重

点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸

序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关

系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋

白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基

酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原

来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领

域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以

及药物研发、基因治疗等等方面。

通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就

以DNA重组技术进行定点诱变(一)

因为所有这些诱变因子都
D N A
导人细胞或噬菌体体内
是渗人细胞内与的
.
发生作用而致变
,
表达
最后可以通过特定的甄别手段把目
.
许多类诱变因子的诱变机理已探明
,
的克隆子挑选出来
一般情况下
.
目的克
如紫外线造成嚓陡
口处的 ’ 5端
.
.
另一条
,
而后根据实际需要
从刻
这样插人处理自然是
D NA
t u s D N A 多聚酶开创出由 M lc
,Fra Baidu bibliotek
插人的
小片段可
一小段缺口
C )
.
或由
D N A
酶
口
E
o l 从刻口 x
1
以是来自别的细胞的 D N A 片段或是人工
D NA
,
制性酶切位点
切割后去除两个切点间的
。
因真核生物
的复制原点很
N TG
小片段而达到删却目的个酶切位点切割
,
另外也可以对一

基因的定点诱变

即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质

Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，获得满足需要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组图10-5

以两个以上的有一定同源性的DNA片段为模板进行PCR反应，通过交换模板机制实现DNA序列的重新组装。不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组图10-6

用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同位点的短DNA片段混合物（含有少量点突变），以这些短DNA片段为引物重新组装成全长基因。
基因直接进化的步骤

突变
基因突变库的建立

筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变

是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因。研究基因的结构与功能的关系，获得所需功能的突变体蛋白质主要方法有：随机诱变，DNA体外重组，寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失

定点诱变的原理和应用

1. 引言

定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。本文将介绍定点诱变的原理和应用。

2. 定点诱变的原理

定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主

细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位

点上。定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：

•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。

•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。

•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。

•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。

3. 定点诱变的应用

定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。以下是其中几个

常见的应用领域：

3.1 基因功能研究

定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。通过在目标位点上插

入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。

3.2 疾病模型构建

定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。通

过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。

基因定点诱变的方法及原理

基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。

目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：

1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。

2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。

3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）

分子生物学定点诱变liu

AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT
3′ 5′

变性退火 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ ATTCGT 5′ AGGCTT TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ 延伸 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 3′ 5′
第一节
定点诱变
一、定点诱变的概念
利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。
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定点诱变技术1

SBS Genetech公司的Muta-direct™ Site Directed Mutagenesis Kit Stratagen公司的QuikChange® Multi SiteDirected Mutagenesis Kit
TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法
寡聚核苷酸介导的突变
保真度高操作复杂周期长
盒式突变简单易行突变效率高
PCR介导的突变操作简单突变成功率高
优点
缺点
合成多条引物成本高后续工作复杂受到酶切位点的限制 TaqDNA聚合酶保真性偏低
应用产品
一步反向PCR法
Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒
Steps of Muta-direct™ Site-Directed Mutagenesis Kit
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method
大引物PCR法

定点突变技术——从单点突变到多点突变

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli

中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过

13 第十三讲 (2)基因的定点诱变

3 PCR诱变
概念：利用人工合成带突变位点的引物通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
重叠延伸PCR诱变(overlap extension) 利用4条引物，3轮PCR反应来完成，可在 DNA区段的任何部位产生定点突变。
重组PCR定点诱变步骤： ⑴分段扩增； ⑵形成异源双链分子； ⑶外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增。
思考题：基因定点诱变技术有哪些？
2.1 基本流程 ⑴化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成 DNA的引物；
⑵由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的dsDNA; ⑶对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。
2.2 诱变寡核苷酸的设计原则诱变寡核苷酸必须含有至少1个碱基改变，如插入、缺失和替换等。
基百度文库定点诱变
基因的定点诱变(site directed mutagenesis)：对基因或DNA序列中特定碱基实施取代、插入或缺失的过程。
1 盒式诱变
又称DNA片段取代法概念：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
1 盒式诱变
2 寡核苷酸引物诱变

第三章+定点诱变技术

第三章DNA突变技术

基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。

根据其特点可将基因突变技术分两大类：

1.位点特异性突变定点突变

2.随机突变表型筛选

随机突变

易错PCR法(Error-prone PCR)

降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP

缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+

DNA Shuffling

外显子、单基因和基因家族的重组装随机引物延伸法

交错延伸法

定点突变

点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube

Random fragmentation of a pool of related genes;

Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);

PCR amplification with primers of reassembled products

How DNA shuffling works

Similar mutants generated by

error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras

基因定点诱变

西北师范大学
基因工程
第二章基因工程技术原理
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第四节基因定点诱变
返回第二章
2.4.1 盒式诱变
利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列.
西北师范大学
2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物,启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分。
基因工程
第二章基因工程技术原理
西北师范大学
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成突变引物合成异源双链DNA分子制备 wk.baidu.com闭环异源双链DNA分子富集转化突变体筛选寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
基因工程
第二章基因工程技术原理
西北师范大学
基因工程
第二章基因工程技术原理
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由 T.A.Kunkel发明
ung:尿嘧啶脱糖苷酶
西北师范大学
基因工程
第二章基因工程技术原理
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局部消化后，进行聚合反应，从而产生具有定点突变的异源双链DNA