基因的定点诱变

即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质

Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5


以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6

用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
基因直接进化的步骤

突变
基因突变库的建立

筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变


是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质 主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
4 化学诱变

化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲 基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA 片段，产生随机突变体库。
DNA体外重组

依赖序列同源性的DNA体外重组，包括 DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸 （StEP)，随机引发重组（RPR).
2. DNA shuffling （DNA 重排或改组）
EcoRI
简 单 盒 式 取 代 诱 变
突 变DNA 野 生 型DNA HindIII EcoRI 野 生 型DNA
混合寡核苷酸诱变

用于取代的是含有随机突变的混合双联 寡核苷酸，可引入大量的随机突变。
在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性 内切酶位点，以便介导它们互为引物

3增变菌株的诱变作用
Biblioteka Baidu

杂交退火
TCAGGCT AGTACGA
DNA聚 合 酶
DNA连 接 酶
TCAGGCT AGTACGA
TCATGCT
TCAGGCT AGTCCGA
转化大 肠杆菌 野生型 突变型
局限性：突变体子代频率低


退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷 酸配对 细胞内甲基介导的错配修复机制会修复 新合成链中的错配碱基


突变是研究基因结构与功能的最基本手 段。 经典的方法是根据突变体的表型，采用 遗传学的方法鉴定相应的基因。
传统的诱变方式

利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体
射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）



不足：
生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难
2. 盒式诱变
Cassette mutagenesis
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野 生型基因中的相应序列 包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变
野 生 型DNA 人工合成的寡核苷酸片段 HindIII 移走小片段 EcoRI HindIII EcoRI 退火 HindIII 突变体序列 HindIII EcoRI DNA连 接 酶
第一节 随机诱变



随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突 变，引入位置和性质均为随机性的。 包括：1.错误掺入诱变（易错PCR) 2.盒式诱变 3.增变菌株的诱变作用 4.化学诱变
随机突变的策略：
1. 易错PCR（error-prone PCR）
在扩增目的基因的过程中，通过改变 PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、 改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入 碱基错配，导致目的基因的随机突变
②基本步骤：



将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体， 制备单链DNA 将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法
AGTACGA
单 链 的M13 重组分子
TCAGGCT
化学合成的寡核苷酸
DNA shuffling 是指DNA分子的体外重 组,是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有 的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表 达产物以新功能
基本步骤:




目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个 基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同 源性的基因 DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左 右的小片段 不加引物的 PCR ：在 Taq 酶的作用下将切割后的 DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可 能发生许多突变和重组 加引物的 PCR ：加入目的基因片段两端的引物 , 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：



人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。


流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。