定点诱变技术
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DNA Shuffling
外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法 交错延伸法 定点突变
点突变——碱基删除、增补和替换
易错PCR(epPCR)
How DNA shuffling works
How DNA shuffling is done in the tube
Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
Steps of Muta-direct™ Site-Directed Mutagenesis Kit
资料表明，引入3个定点突变的效 率为60%，5个定点突变的效率为30%。
Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method
第三章 DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基 因片断的插入与删除等。 根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变 2.随机突变 定点突变
表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
SBS Genetech公司的Muta-direct™ Site Directed Mutagenesis Kit Stratagen公司的QuikChange® Multi SiteDirected Mutagenesis Kit
TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit
一种简便快速的定点突变的方法
Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链
DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在
1～2d内即可完成点突变过程。 DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种 质粒中都会出现，而且不止一次。
Overview of the QuikChange® XL site-directed mutagenesis method.
.
Family gene shuffling library of chimeras
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
耐热p-硝基苯酯酶的分子进化 (Lori Giver等，1998）
The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573) are shown in red. Two mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908) are shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on the protein surface (Val9 and Gln135) are shown in green. The rest of the substrate binding and active site residues are shown in yellow..
PCR amplification with primers of reassembled products
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
.. . . . . . . ..
Single gene shuffling library of point mutants
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但
在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基
因组DNA中将含有20-30个尿
嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。 此法的成功关键，是要得 到好的含Ｕ单链模板DNA。
检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基
结合能力中的作用
获得突变蛋白
定点突变的类型
寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚
核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA
分子进行复制。
盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
PCR介导的基因突变
DNA定点突变的种类
寡聚核苷酸介导
替换、插入、删除
盒式突变
PCR介导
寡聚核苷酸介导法
在dut+的E. coli中 dUTP
dUTP酶
dUMP
在dUTP 酶缺失体中（dut- ）
dUTP dUMP
dut：dUTPase突变，可导致E.
coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，
可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突变的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
噬菌粒载体 （phagemid ）
无5‘-3’外切活性 3‘-5’外切活性低
M13K07辅助感染 产生带 U 的单链 DNA
这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变
位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
盒 式 定 点 突 变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR
大引物PCR法
在基因5’和3’末端产生突变
重叠延伸法定点突变技术的原理示意图
重叠延伸PCR法小结
缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中 间产物进行纯化。 优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运 用非常广泛。
同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区
段进行取代、插入、缺失的突变。
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法
寡聚核苷酸 介导的突变
保真度高 操作复杂 周期长
盒式突变 简单易行 突变效率高
PCR介导的突变 操作简单 突变成功率高
优点
缺点
合成多条引物成本高 后续工作复杂 受到酶切位点的限制 TaqDNA聚合酶保真性偏低
应用产品
一步反向PCR法
Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Fragment with DNAห้องสมุดไป่ตู้eI
X XXX X
Reassemble fragments
XXX X
Select best recombinants
XXX
XX
X
XX
X
XX
X
XXX
X
XXX
X
XXX
X
XX XXX
XX
XXX
XX X
X
XX
X
X
XX
X
X
XX X
XX
X
XX
X
XX
X
Repeat for multiple cycles
重 组 装 的 过 程
DNA
磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化
（Jae Kwang Song等，2000）
β-葡糖苷酶耐热性的提高 (Marý ´a Jesu´ s Arrizubieta等，2000）
外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法 交错延伸法 定点突变
点突变——碱基删除、增补和替换
易错PCR(epPCR)
How DNA shuffling works
How DNA shuffling is done in the tube
Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
Steps of Muta-direct™ Site-Directed Mutagenesis Kit
资料表明，引入3个定点突变的效 率为60%，5个定点突变的效率为30%。
Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method
第三章 DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基 因片断的插入与删除等。 根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变 2.随机突变 定点突变
表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
SBS Genetech公司的Muta-direct™ Site Directed Mutagenesis Kit Stratagen公司的QuikChange® Multi SiteDirected Mutagenesis Kit
TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit
一种简便快速的定点突变的方法
Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链
DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在
1～2d内即可完成点突变过程。 DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种 质粒中都会出现，而且不止一次。
Overview of the QuikChange® XL site-directed mutagenesis method.
.
Family gene shuffling library of chimeras
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
耐热p-硝基苯酯酶的分子进化 (Lori Giver等，1998）
The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573) are shown in red. Two mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908) are shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on the protein surface (Val9 and Gln135) are shown in green. The rest of the substrate binding and active site residues are shown in yellow..
PCR amplification with primers of reassembled products
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
.. . . . . . . ..
Single gene shuffling library of point mutants
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但
在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基
因组DNA中将含有20-30个尿
嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。 此法的成功关键，是要得 到好的含Ｕ单链模板DNA。
检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基
结合能力中的作用
获得突变蛋白
定点突变的类型
寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚
核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA
分子进行复制。
盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
PCR介导的基因突变
DNA定点突变的种类
寡聚核苷酸介导
替换、插入、删除
盒式突变
PCR介导
寡聚核苷酸介导法
在dut+的E. coli中 dUTP
dUTP酶
dUMP
在dUTP 酶缺失体中（dut- ）
dUTP dUMP
dut：dUTPase突变，可导致E.
coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，
可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突变的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
噬菌粒载体 （phagemid ）
无5‘-3’外切活性 3‘-5’外切活性低
M13K07辅助感染 产生带 U 的单链 DNA
这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变
位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
盒 式 定 点 突 变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR
大引物PCR法
在基因5’和3’末端产生突变
重叠延伸法定点突变技术的原理示意图
重叠延伸PCR法小结
缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中 间产物进行纯化。 优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运 用非常广泛。
同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区
段进行取代、插入、缺失的突变。
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法
寡聚核苷酸 介导的突变
保真度高 操作复杂 周期长
盒式突变 简单易行 突变效率高
PCR介导的突变 操作简单 突变成功率高
优点
缺点
合成多条引物成本高 后续工作复杂 受到酶切位点的限制 TaqDNA聚合酶保真性偏低
应用产品
一步反向PCR法
Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Fragment with DNAห้องสมุดไป่ตู้eI
X XXX X
Reassemble fragments
XXX X
Select best recombinants
XXX
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X
Repeat for multiple cycles
重 组 装 的 过 程
DNA
磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化
（Jae Kwang Song等，2000）
β-葡糖苷酶耐热性的提高 (Marý ´a Jesu´ s Arrizubieta等，2000）