抗酸染色法SOP

（一）试剂的配制

1 ．石炭酸复红染液：

（1 ）储存液

①碱性复红液：碱性复红8g，加95% 乙醇至100ml ，充分振荡使复红溶解。碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过6 个月。

②5% 石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml 。

（2 ）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml 充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。碱性复红（或称为碱性品红，basic fuchsin，or pararosaniline chloride，分子式为C 19 H18NCl）用于AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过88% 的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于88% ，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为75% 的产品，配制100ml 储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。

石炭酸（苯酚，phenol ，分子式为C 6 H6 O）:应使用熔点为40.5 ℃的分析纯试剂。

2 ．5%盐酸乙醇脱色液：35% 浓盐酸5ml 与95% 乙醇95ml混合。

3 ．亚甲蓝复染液：

（1 ）储存液：亚甲蓝0.3g 溶于95% 乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积

100ml 。

（2 ）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06% ，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride ，分子式为C 16 H18 ClN3S）：染色时必须使用染料含

量超过82% 的生物染色剂。

4 ．萋－尼氏染色步骤：

1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm 以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4 次）。

2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜(菌膜)，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 分钟。染色期间始终保持痰膜(菌膜)被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。

*如样本是菌液，可加入少量血清或用紫外灯照射30min，增加菌液在玻片上的粘附力。

3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。

4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。

5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。

6. 滴加亚甲蓝复染液，染色30 秒钟。

7. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。