抗酸染色法SOP
抗酸染色——标准操作
抗酸染色一、原理本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
二、试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液三、方法1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2.固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3.染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块四、结果判定1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野五、注意事项1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥六、临床意义分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。
抗酸染色法实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除抗酸染色法实验报告篇一：抗酸染色法抗酸染色法目录1简介2抗酸染色的原理3抗酸染色一般步骤?1）初染?2）脱色?3）复染4抗酸染色的染液配制简介编辑抗酸染色法acid－faststainingmethod1882年由埃利希（F．ehrlich）首创并经F．齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。
其中最具代表性的为对结核菌的齐尔-尼尔森（Ziehl－neelsen）染色法和齐尔-加贝特（Ziehl－gabbet）染色法。
用石炭酸复红染色后，用盐酸乙醇分色，再用美蓝进行对比染色，即不再脱色而呈现石炭酸复红的红色。
抗酸染色的原理编辑分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
抗酸染色一般步骤编辑1）初染用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
2）脱色3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。
3）复染用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。
抗酸染色的染液配制编辑1、石炭酸复红碱性复红酒精饱和溶液10mL5%石炭酸90mL2、3%盐酸酒精浓盐酸3mL95%酒精97mL3、吕氏美兰液美兰酒精饱和液30mL氢氧化钾（1:10000）100mL篇二：实验二十四抗酸染色-jpkchnadlcn课程名称：微生物学检验技术授课专业：医学检验学时：2学时实验十七结核杆菌检验(m.TuberculosisTest)一、实验目的⒈掌握结核杆菌的菌落特征，镜下形态、染色特性⒉掌握抗酸染色的原理、操作步骤，结果报告二、实验器材与试剂⒈菌种：bcg⒉试剂：抗酸染液⒊其他：三脚架、铁片、木夹子等三、实验内容㈠微生物学诊断⒈标本采取根据病灶器官取材,包括痰,尿,脑脊液,粪便等。
抗酸染色概要(1)
夹层杯抗酸染色制片法概要一：标本的预处理：消化和离心1.将标本至于夹层杯中加消化液消化至液体清亮（2~5分钟可灭活细菌）（若是其它容器取痰的，可小心的在痰上加些许消化液，待痰不再粘附其上后转入夹层杯）（夹层杯可装液体不超过杯身三分之二）（非痰类标本亦须加适量消化液消化）。
2.将本杯置于离心机内对称平衡放稳，以4500转/分钟转速离心5分钟，弃去液体（轻快的倒掉），放在干片机内烘烤（干片机提前开启至60度）。
二：染色：初染和洗脱和复染1.加A液在60度温度下染色5分钟。
2.B液脱色（尽量将红色脱净）。
3.C液复染一分钟。
（每次弃去染色液后需以缓慢小水流沿杯壁将杯中剩余液体洗清沥干）。
（加染液液量以可覆盖膜片为适量）三：制片：取片和阅片1.将染色后的片子烘干。
2.用取片针顶起杯底纳米膜片，用镊子夹出，轻轻印干水分，用中性胶倒封于玻片上，弃去保护膜。
（水分将会影响胶水对膜片的粘附）3.阅片。
（可利用“红十字”找寻视野）四：注意事项1.膜片上的细菌的保护：本制片法的原理为通过离心沉降并烘烤将目标菌粘附在膜片上后进行染色，在操作过程中必须避免直接冲刷、液体剧烈振荡、大力印擦等而将膜上已粘附的细菌冲走，这些失误会严重影响阳性率。
2.各标本间的交叉污染：标记混淆、杯中液体互溅、液体转移等将会使结果严重不可靠。
3.脱色的程度：脱色不完全将导致膜上非抗酸菌或其它物质也呈现红色，脱色过久过重会影响抗酸杆菌所着色，二者都将影响后续镜检。
4.B液：其重要成分为酒精盐酸，易挥发，用完务必盖好盖子。
5.操作时间段的把握：请有效利用机器与时间间隔，避免标本堆积。
001抗酸染色法
操作人员：经批准人授权的本院专业技术人员
部门主管：彭建宏
质量控制员：唐日升
目的：保证测试结果的准确性。
适用仪器范围：双目显微镜。
该SOP变动程序：
本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、质控主管、科主任。
应用范围：
抗酸染色法的手工操作。
方法学原理：
目前认为由于抗酸菌含有分枝菌酸，可与石碳酸复红牢固结合，不易被盐酸酒精脱色。
另外，保持菌体表层的完整结构，也是抗酸性的重要条件。
因其不允许被石炭酸复红染上色的类脂外溢，所以抗酸菌虽经脱色仍能保持红色，非抗酸菌被复染为蓝色。
试剂：
石炭酸复红液，5℅盐酸酒精，稀释美蓝液。
标本采集：
按要求留取各种标本及时送检。
操作步骤：
1）将厚涂片经火焰固定后，滴加第一液用火焰微热至出现蒸气约5分钟（亦可采用长方型电热套装置加温），待冷，水洗。
2）加第二液脱色至几无红色为止，但脱色时间不可超过10分钟（以免将抗酸菌的红色脱掉）水洗。
3）加第三液复染30秒钟，水洗，待干镜检。
如为集菌涂片可延长复染时间2–5分钟。
结果：
抗酸菌呈红色，背景及其他细菌呈淡蓝色。
参考文献：
叶应妩，王毓三，申子瑜全国临床检验操作规程，第三版，南京东南大学出版社，2006。
微生物抗酸染色步骤
微生物抗酸染色步骤如下：
1. 准备试剂：选择合适的载玻片，用9%的冰醋酸溶液浸湿载玻片。
用无菌操作取瑞氏染液、美蓝染液、无菌生理盐水，分别滴加到染色槽中，确保每个槽中液体的高度占据染色槽的2/3。
2. 涂片：采取标本时，应使用无菌操作取少量标本放入无菌离心管中，加入少量的无菌生理盐水，振荡离心管使标本充分溶解。
用吸管吸取少量的溶解标本均匀涂布在载玻片上，注意应避免标本在载玻片上形成气泡。
3. 抗酸染色：用竹镊子将涂有标本的载玻片拿起来，先加入少量美蓝染液，盖上盖玻片，避免染液进入对下步观察产生干扰。
用同样方法加等量无菌生理盐水洗去染液后，再滴加少量瑞氏染液，迅速用滤纸吸去多余染液。
4. 镜检观察：染色后，待染色液稍干后，用显微镜观察染色情况。
如果是抗酸阳性杆菌，则会被染成蓝色或淡蓝色；而其他革兰阴性杆菌则会被染成红色。
微生物抗酸染色主要用于区分抗酸杆菌和其他革兰阴性杆菌，尤其是在结核病诊断和疫情监测中具有重要意义。
不同微生物的抗酸染色结果可能会因为菌种的差异而略有差异。
具体操作时应注意无菌操作和染液的配制方法，以及涂片、染色和观察的技巧。
以上内容仅供参考，建议到正规医疗机构进行咨询，获取更全面和准确的信息。
抗酸染色法实验报告
抗酸染色法实验报告抗酸染色法实验报告引言：细胞与组织的染色是生物学和医学研究中常用的技术手段之一。
抗酸染色法是一种常见的细胞和组织染色方法，其原理是在酸性条件下，利用染色剂与细胞或组织中的特定成分发生化学反应，从而使其显色。
本实验旨在通过抗酸染色法观察细胞和组织的结构，以及研究其功能和特性。
实验材料与方法：实验所需材料包括：细胞或组织样本、酸性染色剂、显微镜、玻璃片、显微镜载玻片、显微镜盖玻片等。
实验步骤如下：1. 准备细胞或组织样本：选择合适的细胞或组织样本，如植物叶片、动物组织切片等。
将样本切割成适当大小，并保持其新鲜。
2. 固定样本：将样本浸泡在适当的固定液中，如福尔马林或乙醛溶液中，以保持其形态和结构。
3. 抗酸处理：将固定的样本经过脱水和透明化处理后，放入抗酸剂溶液中浸泡一段时间。
抗酸剂的选择应根据实验目的和样本特性来确定。
4. 染色处理：将抗酸处理后的样本放入酸性染色剂溶液中，浸泡一定时间，使其与样本中的特定成分发生反应。
5. 清洗与固定：将染色后的样本用去离子水或适当的缓冲液进行清洗，以去除多余的染色剂。
然后，用适当的固定剂固定样本。
6. 制片与观察：将固定的样本切割成薄片，并放置在显微镜载玻片上。
然后，用显微镜盖玻片覆盖在样本上，以便观察。
实验结果与讨论：通过抗酸染色法，我们成功地染色了细胞或组织样本，并观察到了其结构和特性。
染色后的样本在显微镜下呈现出明亮的颜色，使我们能够清晰地观察到细胞和组织的细节。
在染色过程中，染色剂与样本中的特定成分发生反应，从而使其显色。
不同的染色剂对不同的细胞和组织成分有选择性，因此可以通过不同的染色剂来观察不同的结构和功能。
例如，我们可以使用伊红染色剂来染色细胞核，使其呈现红色。
细胞核是细胞的控制中心，其中包含着遗传物质DNA。
通过观察细胞核的形态和数量，我们可以了解细胞的增殖能力和功能状态。
此外，我们还可以使用嗜酸性染色剂来染色细胞质中的酸性成分，如染色体和核糖体。
24小时尿液抗酸染色标准操作程序
24小时尿液抗酸染色标准操作程序1 目的有效发现抗酸性细菌。
2 原理结核杆菌、麻疯杆菌等抗酸性细菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质的皮膜而不易着色，但一经着色后不易被酸性酒精脱色，仍固有最初色素的颜色（红色）。
3 试剂3.1 BASO结核菌染色液3.2 贮存条件：贮存于15~30℃，相对湿度不大于80%，无腐蚀性气体和通风良好的室内。
4 标本采集与接收24h尿标本由患者收集后全部送检，最好连续留取三次，按标本签收程序签收。
5 操作步骤5.1 标本分析5.1.1 收集24小时尿液加入明矾沉淀后取沉淀物离心并涂片，待干燥。
5.1.2 加Cabolfuchsin染色5分钟或更久，水洗。
5.1.3 加Acid Alcohol脱色2分钟。
水洗。
5.1.4 加Methylene Blue复染30秒。
5.1.5 干燥，镜检。
5.2 检验结果的录入和确认5.2.1 打开电脑，启动LIS程序，输入用户名及口令后，进入检验程序。
5.2.2 选择“检验录入”，进行检验结果的录入及修改。
通过申请序号进行结果的输入选择“住院号”，输入检验结果，并对患者以前检测结果进行历史回顾，观察变化趋势。
5.2.3 检验结果的确认：检验结果的确认应由主管技师(主治医师)或专业负责人进行确认，方法为单击“信息处理”菜单，核对检验结果后，按“审核”键进确认。
6 结果判定6.1 抗酸性菌：呈红色，6.2 其他细菌及细胞：呈蓝色7 质量控制7.1 试剂用完后，要迅速盖好，以免挥发。
7.2 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
7.3 试剂效期过后，不能使用。
7.4 试剂贮存时，尽量避免高、低温环境及阳光直射。
7.5 受试验条件及个体差异限制，本试验阴性不能说明未感染结核分枝杆菌。
8 临床意义8.1 结核分枝杆菌不产生内毒素和外毒素，大量生长繁殖，机体对菌体成分与其代谢产物引起免疫损伤及变态反应，导致一系列组织细胞学上变化。
抗酸染色标准操作规程
抗酸染色标准操作规程1.【目的】规范抗酸染色标准操作规程。
2.【职责】2.1实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.2本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
3.【试剂组成】3.1石炭酸复红3.2脱色液（3%盐酸酒精）3.3碱性美兰溶液4.【测定原理】抗酸杆菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状，此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫红色;而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。
5.【操作步骤】5.1初染涂片上滴加石炭酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，但切勿热至沸腾或烧干，移开火，静置5分钟，水洗。
5.2脱色一边摇动一边用脱色液脱色，大约1分钟，不再有染色液浮出为止。
5.3复染水洗后滴加碱性美兰复染约20-30秒，水洗。
6.【结果计算与判断】在蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色。
7.【临床意义】只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。
8.【注意事项】8.1操作人员要戴罩、手套和穿隔离衣。
8.2涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量0.5% “84”消毒液（含有效氯25mg/L）后涂片。
气管刷检送检的玻片，紫外线灯下照射30分钟进行染色镜检。
或者对于进行抗酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。
8.3镜检后的玻片均浸泡在含有效氯10mg/L的消毒液中，高压灭菌后处理。
8.4所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。
8.5每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在同一张载玻片上。
8.6为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。
8.7操作人员要戴罩、帽子，穿隔离衣。
8.8涂片制作在生物安全柜内进行。
8.9所有的污物要进行高压灭菌处理。
抗酸染色镜检的操作规程
抗酸染色镜检的操作规程1.目的:通过抗酸染色鉴别结核杆菌.2.原理:一般认为抗酸性菌体内含脂类物质较多,此物质具有抗酸的性质.染色时,它与石碳酸复红结合牢固,能抵抗酸性酒精的脱色作用,同时脂类又不易透过细胞膜,不能被脱色,因此抗酸菌能保持复红的颜色.相反,非抗酸性菌体内含脂类少,易被酸性酒精脱色,脱色时又易从细胞膜渗出而脱掉,最后被复染蓝色.3.试剂:3.1试剂来源:购买珠海贝索3.2试剂盒组成:R1:石碳酸复红溶液1χ100ml R2:酸性酒精溶液1χ100mlR3:亚甲基蓝溶液1χ100ml4.质量控制:室内质控包括痰标本收集,痰片染色和镜检结果复查.痰涂片应保存供上一级参比实验室质量控制检查.5.标本采集与处理:5.1病人留标本前用清水漱口,用力咳出来自支气管深部的脓样或粘液样痰,量不少于3ml避免留唾液或鼻咽部分泌物.5.2夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液.5.3初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰),痰液不合格者重送.5.4涂片:取脱脂过的干燥、清洁、无油污的新玻片，在玻片背面的左端1/3处以记号笔编号,用折断的竹签挑取痰标本的脓样,干酪样0.1ML,于玻片上均匀涂抹成2ⅹ2.5CM卵圆形痰膜,自然干燥后待检.6.染色方法:6.1用片夹夹住涂片火焰固定,加石碳酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现染5分钟,水洗.6.2加脱色剂,不时摇动玻片至无色脱落为止,水洗.6.3加复染液,染0.5-1分钟,水洗涂片后镜检.7.镜检:取染好的干燥涂片,用低倍镜、高倍镜览片,最后在涂片上滴1-2滴香柏油,用油镜仔细观察.8.结果的判断:结核杆菌呈红色,其它细菌呈蓝色.9.实验完后的处理:9.1先用擦镜纸将镜头上的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净擦镜纸擦2-3次,向一个方向擦拭。
9.2废弃玻片放入5% 84消毒液中浸泡60分钟,消毒液要每天更换。
9.3痰盒和废弃标本等污染物应弃于有盖的污物桶内,消毒后焚烧。
微生物室SOP文件
微生物室SOP文件-抗酸染色标准操作规程2010-05-27 06:23:44 作者：佚名来源：网络转载检验目的及临床实用性多用于结核杆菌和麻风杆菌的检查，往往根据涂片检查作出临床诊断，因而必须保证结果正确可靠，为防止污染，标本应灭菌后涂片染色。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性。
取培养菌落涂片染色时，可见检验目的及临床实用性多用于结核杆菌和麻风杆菌的检查，往往根据涂片检查作出临床诊断，因而必须保证结果正确可靠，为防止污染，标本应灭菌后涂片染色。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性。
取培养菌落涂片染色时，可见部分菌细胞染色阳性，另一些染色阴性；有时同一菌体上红色深浅亦有不同。
标本采集与处理选择正确生理部位和采集合适的标本及其正确运送等环节至关重要。
而所有与标本质量有关的检验工作者必须要了解在整个实验过程中保证标本质量的重要性和必要性。
标本的选择与采集：采集送检标本前，标本选择的种类和采集部位必须反映有效病程。
一个没有有效病原体的标本是没有临床诊断价值的。
要避免常居菌群随时可能造成的污染，以确保取得反映感染过程的典型标本。
标本的送检: 所有标本都必须立即送往实验室前沿，最好在2小时内。
如不能及时送检，细菌病原体待检标本应按规定条件下存放，通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过２４小时。
临床标本或传染性材料从一个实验室到另一个实验室的送检，不论距离长短，都要求严格注意标本的包装和标签说明。
所要运送的材料必须贴上适当的标签，包装得当。
送检期间要予以安全防护。
试剂石炭酸复红碱性复红10g95％酒精100ml5％石炭酸900ml （边加边研磨）盐酸脱色液（3％盐酸酒精）浓盐酸3ml95％酒精97ml吕氏美兰美兰0.3g95％酒精30ml蒸馏水70ml10％KOH水溶液0.1ml染色方法涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
反复染5分钟,清水冲洗。
加盐酸脱色液，不时摇动玻片至无红色脱落为止，清水冲洗。
革兰染色与抗酸染色操作规范
一、实验原理G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。
G－菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄或稀释石碳酸复红复染后呈红色。
二、实验器材【载玻片、试管架、红蓝铅笔、接种环、记号笔、酒精灯、打火机、生理盐水、吸水纸、冲洗瓶】、钟表、显微镜、香柏油、擦镜纸、染色盘、染色架、消毒洗手液等。
三、实验试剂革兰染液：草酸铵结晶紫染液、碘液、脱色液（95%乙醇）、蕃红复染液。
四、实验标本痰液五、操作步骤1.标记选择玻片并正确编号（标本号）2.涂片用灭菌接种环挑取菌落与载玻片上预先滴加的生理盐水涂布成1cm2或蚕豆大小的半透明菌膜。
3.干燥涂片制成后，在空气中使其迅速干燥，以免菌体皱缩变形（若需加快干燥速度，将涂布面朝上，置于火焰上方，不烫手的位置，慢慢烘干，切勿紧贴火焰）。
4.固定玻片干燥后火焰加热法固定，即玻片（菌膜面向上）中速从火焰上端通过3次进行固定，以玻片反面接触手背皮肤，热而不烫为宜。
5.初染加结晶紫染液染60s，细流水冲洗，并倒去玻片上积水。
6.媒染加碘液染60s，细流水冲洗。
7.脱色加脱色液，不时摇动10s~30s，至无紫色逸出为止，细流水冲洗。
8.复染加复染液，染30s~60s，细流水冲洗。
9.镜检待已染色的细菌标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，再用显微镜进行观察，先用低倍镜观察，再滴加一滴香柏油用油镜观察。
注意：染色时间不同试剂有所不同。
六、结果观察1、紫色：G+2、红色：G-一、实验原理：分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。
抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
结核杆菌涂片检查标准操作程序
SOP_15-16 结核杆菌涂片检查标准操作程序一、目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。
二、适用范围：结核杆菌涂片检查三、操作人员：检验科授权工作人员四、操作步骤：1、原理抗酸染色的基本原理是抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。
此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性乙醇脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性乙醇脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。
2、染色液的配制2.1碳酸复红染液：全省统一配送2.2 5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5mL与95%乙醇混合2.3亚亚甲蓝染色液：全省统一配送3、载玻片的准备：用于AFB检查的载玻片要求：⑴一张载玻只能涂抹一份痰标本。
⑵每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。
新的载玻片放入95%乙醇中浸泡2小时脱脂，用摄子夹出放干净纱布上阴干，放无尘容器（培养皿）中备用。
4、本的采集、运送及处理4.1初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、晨痰和即时痰）。
如无夜间痰，在留晨痰后2-3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。
疗程中或复诊随访病人按期每次送检2份痰（晨痰和夜间痰）。
痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。
4.2收集标本的容器应采用WHO推荐的标准痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的可密封塑料盒或蜡纸盒（我省统一采用蜡纸盒）。
★痰容器上就注明与检验单一致的病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、★检查项目和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰。
3为晨痰）。
5、涂片的制备5.1 编号：取经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片背面左端1/3处注明实验室序号(56001递增)及标本序号（按1递增）（如使用的载玻片一端无磨砂面，须用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。
抗酸染色+标本片
3）复染：用碱性美兰溶液复染1’，用水冲洗后用吸 水纸吸干。
3、油镜观察
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。初染源自脱色复染冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’
3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
白色念珠菌 钩体 枯草杆菌 曲霉
白色念珠菌
钩端螺旋体
类炭疽（枯草杆菌）
炭疽杆菌
曲霉
实验报告
绘制抗酸染色结果镜下图 绘制四张标本片镜下图
抗酸染色+标本片
实验内容
一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作）
二、标本片观察： （钩体 、白色念珠菌，曲霉、枯草芽胞杆菌、）
抗酸染色
材料： 标本：卡介苗 染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝 器具：同革兰氏染色
实验方法：
1、细菌涂片标本的制备
涂片
干燥
固定
2、染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽 即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免 干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
冲洗
干燥
油镜观察
美蓝复染1 ’
三、抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
注意事项：
1、无菌操作 2、菌种管摇匀后取菌 3、涂片均匀 4、初染加热维持3~5分钟，勿沸腾烧干 5、冷却后冲洗 6、油镜下从视野中找红色抗酸菌
二、标本片观察
0002改良抗酸染色(sop)
改良抗酸染色操作程序1 目的改良传统抗酸染色方法，以增加抗酸杆菌检出的阳性率。
2 原理由于抗酸杆菌含有分枝菌酸，可与石碳酸复红牢固结合。
因其不允许被石碳酸复红染上色的类脂质外溢，所以抗酸杆菌虽经盐酸酒精脱色，但仍能保持红色。
而非抗酸杆菌则被染为蓝色。
改良抗酸染色法在标本制备及染色方面的改进，极大地提高了细胞内外抗酸杆菌检出的阳性率。
尤其是细胞内抗酸杆菌的检出，有助于临床判定现症或潜伏感染。
3 仪器3.1 器材3.1.1 FMU-6型细胞涂片离心仪3.1.2 FMU-6型细胞涂片沉淀器3.1.3 显微镜。
3.1.4 载玻片3.2 试剂3.2.1 0.3 % TritonX-100萋纳石碳酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液10 ml5 % 石碳酸溶液90 mlTritonX-100 0.3 ml3.2.2 脱色剂浓盐酸20 ml95 % 乙醇80 ml3.2.3 复染液（吕弗勒美篮液）美篮乙醇饱和溶液30 ml10 % 氢氧化钾0.1ml蒸馏水100 ml3.2.4 0.3 % TritonX-100（曲拉通）溶液TtritonX-100 3 ml蒸馏水1000 ml3.2.5 APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）工作溶液现用现配，用丙酮1:50稀释。
3.2.6 固定液（pH 6.6）丙酮45ml甲醛25ml磷酸氢二钠20mg磷酸二氢钾100mg蒸馏水30ml3.2.7 0.1M 磷酸盐缓冲液（PH7.4）Na2HPO4·12H2O 26.46 gNaH2PO4·2H2O 2.664 gNaCl 40 gKCl 1.8 g蒸馏水900 ml4 操作步骤4.1 载玻片处理将酸碱处理后的载玻片浸泡于APES工作溶液30秒，取出冲洗，晾干，备用。
4.2 标本收集4.2.1 将载玻片和滤纸插入FMU-6型细胞涂片沉淀器中，滤纸上的孔必须与FMU-6型细胞涂片沉淀器上的孔对准，并旋紧FMU-6型细胞涂片沉淀器。
抗酸染色(冷染法)标准操作规程
抗酸染色（冷染法）标准操作规程01原理本试剂盒采用 WHO 推荐的 Ziehl-Neelsen 法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
02试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液03方法1. 涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2. 固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动 3 ~ 4 次，共约 3 ~ 4 秒。
要求玻片温度不超过 60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3. 染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色 10 分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色 1 ~ 2 分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色 30 秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑04结果判定1. 干燥后油镜观察 300 个视野（观察时间不少于 4 min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌 1 ~ 2 条 / 300 视野2.3 找到抗酸杆菌 1+：发现抗酸杆菌 3 ~ 9 条 / 100 视野2.4 找到抗酸杆菌 2+：发现抗酸杆菌 1 ~ 9 条 / 10 视野2.5 找到抗酸杆菌 3+: 发现抗酸杆菌 1 ~ 9 条 / 1 视野2.6 找到抗酸杆菌 4+：发现抗酸杆菌≥ 10 条 / 1 视野05质量控制每次用卡介苗做阳性对照大肠埃希菌 ATCC25922 做阴性对照06注意事项1. 每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆；2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止；3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长；4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意；5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射；6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热；7. 染色时勿使玻片上的染液干燥。
抗酸染色操作
抗酸染色操作程序【检验原理】抗酸染色可将细菌分为两大类，即抗酸性细菌和非抗酸性细菌，因日常大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检测项目，只针对结核病等具有抗酸性细菌标本的染色。
【主要组成成分】1.石碳酸复红溶液2.脱色剂（3%盐酸酒精溶液）3.复染液（吕氏美兰溶液）【样本要求】1.直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率；2.直接用细菌染色，要注意防护，以防生物感染。
【检验方法】1.涂片经火焰固定，加1液徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
染5分钟（若染色奴卡氏菌需要更长时间），水洗。
2.加第2液不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗；3.加3液，染0.5-1分钟，水洗。
4.干后油镜镜检。
【结果判断】分支杆菌在暗背景中呈红色，背景为蓝色。
镜检结果分级报告抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1~8条/300视野抗酸杆菌阳性（1+）：3~9条/100视野，连续观察300个视野抗酸杆菌阳性（2+）：1~9条/10视野，连续观察100个视野抗酸杆菌阳性（3+）：1~9条/每视野抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野【注意事项】1、严格掌握脱色时间，要脱色充分，脱色时间过短易使红色的石炭酸复红染料残留显红色而造成假阳性。
2、在染片过程中，加1液后一定要酒精灯徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，这样才能使细菌充分着色。
3、石碳酸对皮肤、粘膜有强烈的刺激性和腐蚀性，使用时要注意安全，如果不慎沾到皮肤上，立即用水或酒精冲洗。
4、涂片染色阳性只能说明抗酸杆菌的存在，不能区分是结核菌还是非结核分支杆菌。
实验九抗酸染色
3、油镜观察
五、实验结果：
1.结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶 呈分枝状生长。 2.背景及非抗酸性细菌呈兰色。
六、注意事项：
1、涂片要充分研磨，防止细菌成团
2、涂片大小、厚度要适中 3、固定温度合适 4、初染加热的温度，勿沸腾 5、染色时间 6、冲洗
三、实验材料：
细菌：结核杆菌
染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美
兰溶液
其它：接种环、酒精灯、载玻片等
四、实验方法
1、细菌涂片的制备
1）涂片：20mm*15mm厚涂片，竹签挑取，涂2-3遍
2）干燥：自然干燥，或火焰
3）固定：火焰固定，必须
2、染 色
1）初染：滴加石炭 酸复红适量，在火焰高处徐徐加热， 切勿沸腾，出现蒸汽暂时离开火焰；若染液蒸 发减少，应再加染液，以免干涸，加热5min （可延长），待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30sec~1min至无红色液体 流下，再用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1min，用水冲洗后 用吸 水纸吸干。
实验九 抗 酸 染 色
临床病原生物学教研室
一、实验目的：
1. 掌握抗酸染色的原理和方法
2. 掌握细胞壁内含有大量的脂质，包围在 肽聚糖的外面，一般水溶性染料不易进入，所以 分枝杆菌一般不易着色且一旦染色后不易脱色， 所以要经过加热和延长染色时间来促使其着色。 因分枝菌酸与染料结合后，很难被酸性脱色 剂脱色，故分枝杆菌又称抗酸杆菌。
抗酸染色
1 方法:改良碱性复红法。
2 原理：结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。
利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。
3 试剂3.1 妻纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液 10ml5% 石炭酸溶液 90ml3.2 脱色剂浓盐酸 3ml95% 乙醇 97ml3.3 复染液 ( 吕弗勒美蓝液 )美蓝乙醇饱和溶液 30ml10% 氢氧化钾 0.1ml蒸馏水 100ml4 试剂贮存：棕色瓶室温存放。
5 质量控制：每批配制后测试，结核分枝杆菌应为阳性。
6 操作步骤6.1 涂片经火焰固定 , 加石炭酸复红溶液 , 盖满整个痰膜，徐徐加热至有蒸汽出现 , 切不可沸腾。
染 5min( 若染色奴卡菌需要加长时间 ),用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。
6.2 加脱色剂 , 不时摇动玻片至无红色脱落为止 , 用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。
6.3 加复染液 , 染 0.5~lmin, 用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。
6.4 干后镜检。
分枝杆菌呈红色 , 背景为蓝色。
7 结果判断找到细菌或略带弯曲的杆菌，单个或平行相聚排列，有的呈分枝状，有的菌体内常有2-5个着色较浓的颗粒，抗酸染色染成红色，即可判断找到抗酸杆菌。
8 报告方法8.1 抗酸杆菌阴性:连续观察 300 个不同视野 , 未发现抗酸杆菌 ;8.2 抗酸杆菌可疑:1 一8条抗酸杆菌 /300 个视野 ;8.3 抗酸杆菌阳性（1+）:3-9 条抗酸杆菌 /100 个视野 ;8.4 抗酸杆菌阳性(2+):1-9 条抗酸杆菌 /10 个视野 ;8.5 抗酸杆菌阳性（3+）:1-9 条抗酸杆菌 / 每个视野 ;8.6 抗酸杆菌阳性 (4+):>=10 条抗酸杆菌 / 每个视野。
五、抗酸染色与墨汁负染实验
二、墨汁负染色法
步骤
2.滴半滴墨汁.取菌并混匀。 3.盖盖玻片(覆盖于菌液上，注意先将盖 玻片一边接触菌液缓缓斜放下，以免产 生气泡)。 4.油镜观察。
目 录 末页
二、墨汁负染色法
结果观察
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二、墨汁负染色法
临床意义
新型隐球菌可引起全身各组织器官 炎症，最易侵犯的是中枢神经系统，引 起慢性脑膜炎。
《医学微生物学》实验五
右江民族医学院微生物学与免疫学教研室
一、抗酸染色法 二、墨汁负染色法
目 录 末页
一、抗酸染色法 目的
抗酸染色观察结核分枝杆菌的形态。
目 录 末页
一、抗酸染色法
原理
分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量 较高，特别是其中大量分枝菌酸可影响 染料穿入。一旦着色后不易被盐酸酒精 脱色。
目 录 末页
一、抗酸染色法
结果
结果观察:
抗酸阳性菌为红色 抗酸阴性菌为蓝色
目 录 末页
一、抗酸染色法 结果
报告方式（直接涂片法） 仔细观察300视野(观察时间不少于4min)，未
发现抗酸杆菌。 士：可疑。发现抗酸菌l～2条／300视野。 1+：发现抗酸菌3～9条／100视野。 2+：发现抗酸菌1～9条／10视野。 3+：发现抗酸菌1～9条／每视野。 4+：发现抗酸菌≥10条／每视野。
目 录 末页
二、墨汁负染色法 目的
墨汁负染色法观察新型隐球菌的 形态。
目 录 末页
二、墨汁负染色法
原理
新型隐球菌的荚膜较厚，一般不 易着色，同时菌体折光性较强，用墨 汁负染色法可在黑色背景下看到透亮 的菌体。
目 录 末页二、墨汁负染来自法材料1.菌种 新型隐球菌 2.试剂 优质墨汁 3.其他 载玻片、盖玻片、镊子、普通 光学显微镜
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（一）试剂的配制
1 ．石炭酸复红染液：
（1 ）储存液
①碱性复红液：碱性复红8g，加95% 乙醇至100ml ，充分振荡使复红溶解。
碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过6 个月。
②5% 石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml 。
（2 ）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml 充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。
碱性复红（或称为碱性品红，basic fuchsin，or pararosaniline chloride，分子式为C 19 H18NCl）用于AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过88% 的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。
如果标注的染料含量低于88% ，则在配制时需调整称取量。
例如，染料含量标注为75% 的产品，配制100ml 储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。
石炭酸（苯酚，phenol ，分子式为C 6 H6 O）:应使用熔点为40.5 ℃的分析纯试剂。
2 ．5%盐酸乙醇脱色液：35% 浓盐酸5ml 与95% 乙醇95ml混合。
3 ．亚甲蓝复染液：
（1 ）储存液：亚甲蓝0.3g 溶于95% 乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积
100ml 。
（2 ）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06% ，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。
亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride ，分子式为C 16 H18 ClN3S）：染色时必须使用染料含
量超过82% 的生物染色剂。
4 ．萋－尼氏染色步骤：
1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm 以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4 次）。
2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜(菌膜)，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 分钟。
染色期间始终保持痰膜(菌膜)被染色液覆盖，必要时可续加染色液。
加温时勿使染色液沸腾。
*如样本是菌液，可加入少量血清或用紫外灯照射30min，增加菌液在玻片上的粘附力。
3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
6. 滴加亚甲蓝复染液，染色30 秒钟。
7. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。
将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。