菌种选育

1.遗传：单细胞生物能够产生遗传学上与亲种相同的产物，指生物上一代将所有的遗传因子传给下一代的行为习惯。

2.变异：微生物种发生频率很低的可遗传的变化，指生物体在某种外因的作用发生遗传物质结构或数量的改变

3.饰变：不涉及遗传物质结构的改变，而只发生在转录翻译水平上的表型变化，特点是整个群体发生变化，群体中几乎没有个体都发生改变

4.遗传型：又称基因型，某一生物体所含有的全部遗传因子，基因的综合。是一种内在的可能性潜力，并不一定表现出来

5.表型：某以生物所有的一切外表特征及内在特征的综合，是遗传型在合适环境下的表现，与遗传型不同，是一种现实性

6.诱变育种：利用物理、化学或生物诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快捷、高效的筛选放大，从中挑选少数符合育种目的的突变菌株以供生产实践或科学实践之用

7.杂交育种：是基因重组的一种形式（细胞水平的基因重组）

8.突变：生物遗传性突然发生变异，影响生物正常遗传型和性能的现象，自发突变的突变率在10-8到10-9之间

9.诱变剂：方式能够诱发生物基因突变，而且突变频率远远超过自然突变率的物理、化学和生物因子，包括物理诱变剂（通常使用物理辐射中的各种射线，包括紫外线、X射线、β射线、γ射线、微波、超波、激光等）化学诱变剂（一类能对DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质）和生物诱变剂

10.基因重组：将俩个不同性状个体类的基因转移到一起，经过从新组合，形成新的遗传型个体的过程，即指生物体在没有发生突变的情况下产生新的遗传型的现象

11.杂交育种：人为利用真和微生物的有性生殖（有性孢子）、准性生殖（细胞营养体）以及原核生物的转导、转化、F因子等，表达到下一代基因重组的目的

12.突变的分子机制：DNA分子中的碱基序列或碱基对数的改变，或染色体发生变化

13.光复活：经过紫外线照射后的突变体立即用可见光照射，可以简体突变率

14.富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所血药的菌株；主要根据问生物的碳、氮源，PH、温度、需氧等加以控制

15.平皿快速检测法：利用菌体在特定平皿上的生化反应将我们肉眼看不到的生化反应转变为有形的肉眼看得到的现象，从而将菌种分离出来的方法

16.初筛：从

大量分离到微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程





一、微生物遗传变异的特点

1.繁殖快，给育种带来很大的方便 2.外界环境作用的直接性 3.容易培养 4.代谢能力强 5.种类多、分布广

二、菌种选育的任务

1.促使菌种变异（稳定） 2.分离纯化（筛选遗传学上稳定的品种） 3.保藏（找到一个稳定的保存方法）

三、基因突变的类型

1.选择性突变体：凡是能够用选择性的培养基快速悬着出来的突变性即为选择性突变体

A.营养缺陷型：由于突变而失去合成某种代谢物质的能力

B.抗性突变型：有抗药突变、抗噬菌体突变、抗高温和抗辐射突变等

C.条件致死突变型：如温度突变型

2.非选择性突变体：不能用选择性的培养基快速选择出来的突变型即为非选择性突变体

A.形态突变型：光滑与粗糙，菌落的形态、颜色、包子变化

B.抗原突变型：引起抗原结构的改变

C.产量突变型：基因突变引起代谢产量升高或降低

四、基因突变的特点

1.不对应性：与基因突变的性状与引起突变的原因没有直接关系

2.自发性：指在没有明显的外界因素影响下也可发生突变

3.稀有性：发生的变异是稀有的，导致筛选非常困难

4.独立性：在某一群体中，发生的不同基因突变几率是相等的，独立的，并无联系

5.随机性

6.诱变性：突变是诱发的，诱变剂可以提高突变频率

7.可逆性：可以发生回复突变

8.稳定性：基因突变产生的变异是稳定的、可遗传的
五、突变的分类

1.染色体数目的变法（染色体组变）：由于染色体数目发生变化而引起的变异

当二倍体多一条染色体时为2N+1，称为超二倍体；当二倍体少一条染色体时为2N—1，称为亚二倍体；原核生物为不完全染色体，多一条为部分DNA

2.染色体结构的变法(染色体畸变）

A.缺失：是在同一条染色体上具有一个或多个基因的DNA节段丢失引起的突变，不可逆

B.重复：是在同一条染色体的某一处增加一节段DNA，使该染色体上的某些基因重复出现而产生的突变

C.倒位：是染色体受到外来因素的破坏，造成染色体部分节段的位置顺序颠倒导致极性相反

D.易位：非同源染色体之间部分连接或交换

3.染色体局部座位类的变化（基因突变）

A.碱基置换：在DNA链上的碱基序列中的一个碱基被另一个碱基代替的现象

a.转换：嘌呤一嘌呤或嘧啶与嘧啶之间发生互换

b.颠换：一个嘌呤替换另一个嘧啶或一个嘧啶替换另一个嘌呤

B.移码突变：在DNA碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异，可产生回复突变（变异越小，回复突

变几率越多）

六、紫外诱变的操作方法：

1.出发菌株：把细菌斜面培养到对数期、霉菌或放线菌培养到孢子刚成熟

2.前培养：对细菌类以内为主

3.制备菌悬液：离心出去培养基，用生理盐水制备菌悬液

4.紫外线照射 5.观察结果

七、化学诱变剂的要求：

1.选择一种使菌株变异率高，且正突变率高的化学诱变剂

2.选择一种容易得到的化学诱变剂

3.不宜选择毒性强的化学诱变剂

4.诱变后不易产生回复突变

八、常用化学诱变剂的使用方法

1.亚硝酸：取包子悬液1mL，PH4.5磷酸缓冲液2mL及0.1mol/L亚硝酸钠溶液1mL，于25~26度保温10-20min，加入0.07mol/L PH8.6的NaH2PO4 20mL使反应中止，稀释分离平板

九、微生物分离纯化的一般方法：

1.平板涂布法（稀释法）

2.划线分离法：用接种环取部分样品或菌体，在事先准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用，该方法操作简单、快速，但容易漏筛

3.组织分离法：分离高等真菌或植物病原菌

4.厌氧菌的分离：先将焦性没食子酸放在容器中，把含有厌氧产品的培养皿架空放入容器内，然后加入氢氧化钠溶液，立即盖上盖子，并用石蜡或凡士林密封，放到室温下培养

十、平皿检测法：1.纸片显色法：用灭菌的滤纸片载上培养基和显色剂悬空架于空培养皿中；然后将菌悬液滴在纸片上，培养一段时间后，根据纸片是否变色，变色深浅来判断目的菌2.变色圈法：在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需的微生物被快速鉴别出来3.透明圈法：平板培养基中加入溶醉性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物在菌落周围产生透明圈，根据透明圈的大小可以分析菌种分解底物的能力，而菌落的大小与透明圈的大小的比值更能确切的表示分解底物的能力4.生长圈法：适于分离筛选aa，核苷酸和维生素的产生菌，其中工具菌使一些相对应的营养缺陷型的菌株，将待检菌涂布于高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈5.抑菌圈法：与生长圈法刚好相反，常用于抗生素产生菌的分离筛选，待分离的菌能产生抑制工具菌生长的物质，其中工具菌使这种物质的敏感菌

十一、诱变育种的实践意义：1.提高有效产物产量2.改善菌种特性，提高产品质量3.简化工艺要求4.开发新品种
十、诱变育种的基本路线：出发菌株经过诱变绝大数个体死亡，少数存活的菌株多数未产生突变，只有少数发生了变异，而在这少数突变菌株中又只有少部分使正变，少部分正变里面

又只有少数变幅大，在具有上面所有条件产生的菌株中只有少部分能投产使用

十一、诱变育种的原则：1.选择优良的出发菌株（1）以单倍体纯种为出发菌株a、用单倍体的原因是：突变在DNA的一条链上发生。如果是二倍体，则会在培养中出现突变菌和未突变菌俩中菌b、用纯种的原因：如果不是纯种，则易将混合种的少数未突变的菌种认为是变异菌 （2）以生长快、繁殖快、营养要求低、产包子早和多的菌株为出发菌株 （3）选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株（4）高产菌往往是经过积累得到的 2.单孢子悬液：必须是单细胞，均匀的悬液状态 3.选择有效的诱变剂

十二、诱变育种的步骤：出发菌株经过纯化、同步培养得到细胞培养液经过离心、洗涤、玻璃珠子打散得到细胞或孢子悬液，经过预备试验的活菌计数再诱变处理后进行平板分离，通过变异率计数得到初步突变菌再经过初筛、复筛最终进行保存和扩大培养

十三、出发菌株的选择：1.自然界分离筛选获得的菌株，虽产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高2.生产中未经过诱变的菌株：一经诱变产量性能增长很快3.经过基因重组的杂交菌:经诱变，进一步改变其性能4.经过多次诱变的一般高产菌，由于染色体变化大，性能改变小，诱变后易死亡或产生回复突变，可以从副产物、营养要求等方面进行诱变5.突变菌株的敏感型：经碱基类似物诱变后形成不产目的菌，再继续诱变产生回复突变，使性能有更大的提高

十四、诱变剂的选择及处理剂量：1.诱变剂的选择原则（1）根据经验选择诱变剂：不要重复选择同一种诱变剂处理同一菌种，可采取物理和化学相结合的原则（2）用安全、有效的诱变剂，尽量不要用有回复突变的诱变剂 2.诱变剂处理剂的选择（1）处理剂量大，杀菌率高（90%-99%），在单位有活细胞中负变菌株多，正变菌株少（2）用小计量诱变处理时，杀菌率为50%-80%，在单位有活细胞中正突变多，一般用抵计量长时间作用处理菌株（3）二倍体处理剂量大于单位体，多核体计量大于单核体

十五、变异菌的分离和筛选：诱变处理经过培养后得到液体培养传代，再分离，初筛，复筛

1野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株

营养缺陷型：野生型菌株经人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型

原养性：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同

2、筛选营养缺陷型菌株所用的三类培养基：

基本培养基（MM

）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基

补充培养基(SM)：在基本培养基中加入该菌某菌株不能合成的营养因子而组成的，仅满足相应的营养缺陷型菌株

完全培养基(CM)：满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基

3、如何获得营养缺陷型？

（1）用野生型或原养性进行诱变。诱变剂：亚硝基胍，紫外线，亚硝酸等

（2）浓缩营养缺陷型（淘汰野生型）：1抗生素法：一包括青霉素法：可杀死正在生长的细菌，原理是青霉素能抑制细胞壁肽聚糖之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。但不能抑制或杀死处于休眠状态的细菌；二包括制霉素法：可杀死正在生长的真菌，原理是可作用于细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型菌株的作用

2菌丝过滤法：淘汰丝状菌的野生型。一般营养缺陷型不长菌丝，可以将诱变处理的孢子移到基本培养液中，振荡10小时左右，用灭菌的脱脂棉滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。

3差别杀菌法（高温杀菌法）：利用芽孢类和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌转移到MM培养基中，振荡培养一段时间野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发，此时将营养物加热到80度维持一定的时间，野生型大部分被杀死，缺陷型得以保留。

4、检出营养缺陷型（纯种分离）？

（1）逐个挑取法（2）夹层培养法（3）影印法（4）限量补给法

5抗性突变菌株的筛选？

（1） 一次性筛选法：指对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量的抗性变异菌株的方法。包括抗药性，耐高温，耐高渗透压，耐高酒精度

（2） 阶梯性筛选法（药物培养基有阶梯）

（3） 纸片扩散法：一般越靠近纸片的菌抗性越强但也可能产生漏筛现象

（4） 影印法筛选：比一次性筛选法更高的一系列浓度梯度

6抗噬菌体选育方法？

（1） 自发突变

（2） 诱发突变：敏感菌诱变成抗性菌然后筛选。包括一次性筛选法和间接筛选法

7、抗噬菌体菌株的稳定性实验：取样涂布，长出菌落后，加噬菌体，观察噬菌斑

8、区别真正的抗性与溶源性试验：选育好的菌株（真或假），加入敏感菌，有噬菌斑的具溶源性，无的具抗性

7用于生产的抗噬菌体的条件：稳定性好，产量不低于敏感菌，不是溶源性菌株，不带噬菌斑。

8生产过程中噬菌体的来源：菌体带噬菌体；菌体为溶源性；空气中含有噬菌体；来源于环境

9生产过程中出现噬菌体的现象：菌丝不长，OD值不升，PH值升高；泡沫多，粘

性大

防治措施：杜绝来源；立即检测环境；消毒；定期轮换生产菌种

10杂交育种的程序：选择原始亲本、诱变筛选直接亲本、直接亲本亲和力鉴定、杂交、分离到基本培养基或选择性 培养基培养、筛选重组

11接合：指两个性别不同的微生物细胞之间接触，遗传物质转移、交换、重组形成一个新个体

12致育因子：是一种质粒，存在于细胞之中，一般为游离状态，有时和染色体结合状态存在，是一种稳定的遗传物质，与染色体复制不同步。

13 诱变育种的程序

选择出发菌株(parent strain)→制备菌悬液→前培养(添加嘌呤，嘧啶或酵母膏提高变异率)→诱变(物理诱变，化学诱变)→变异菌株的分离和筛选

二、微生物工业对菌种的要求

1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。

2.易控制培养条件，发酵周期较短。

3.抗杂菌和噬菌体的能力强。

4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。





2异核系分析法：取混合培养孢子悬液分离到MM平板上，培养一段时间后发现菌落较小的为异核系菌落，然后将这些菌落接到Cn上增值，最后接到MM二鉴定

2平板杂交法：先将两种菌在选择性培养基上杂交，待形成孢子后影响到完全=培养基上增殖，然后在影响到选择培养基上鉴定，

3玻璃纸混合法：将两亲本孢子混合接种到覆盖于固体CM上的玻璃纸表面，经一定时间培养，将玻璃纸转移到特定的Sm上，继续培养，长出的菌落为部分合子所形成的异核系菌落

三，转导:定义:借助温和噬菌体为媒介，将供体细胞中的部分DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者得到前者的部分遗传性状，获得新的遗传性状的细胞叫转导子

转导子与F因子的区别：

1,F因子转导亲本相互接触，而转导亲本不接触2F因子转导载体是F因子，而转导的载体是混合噬菌体：

转导的类型：

1普遍转导

此类转导形成完全缺陷噬菌体，他将宿主dna片段包裹而本身的Dna没有被包裹

2局限转导

转导形成部分缺陷噬菌体，他将部分宿主的DNA片段和本身的DNa片段一起包裹

四，转化：

定义：某一基因型细胞直接从周围介质中吸收另一种基因型细胞的DNa并将它整合到自己的基因组中，造成基因型和表型发生相应的变化

获得的新遗传性状的细胞叫转化子、

2转化育种的条件

1感受态的出现

1感受态：受体细胞能直接从周围环境中吸收DNA分子并这些DNA分子不被自身的DNA破坏，并能整合到基因组中的状态

感受态出现于以下因数有关：1受体细胞的遗传2受体细胞的生理状态3受体细胞的培养条件4受体细胞的营养

？

3转化过程

A



真核生物的基因重组

1霉菌的杂交育

霉菌的准性生殖：定义：在菌丝生长过程中两个不同的置、遗传类型的的菌丝细胞接触融合，形成异核体，杂合双倍体，最后经染色体相互交换，产生一个具有新遗传类型的菌株，叫准性生殖

准性生殖的三个阶段：

1异核体的形成：异核体当两个或几个基因型不同的菌株的菌丝体在培养过程中紧密接触，继而接触部分的细胞壁溶解，联接，融合细胞质交流，在共同的细胞质中有哦两个或几个细胞核，这种细胞叫异核体

2杂核双倍体的形成：异核体在菌丝分裂中偶尔有核发生融合；形成杂核双倍体相对稳定，

3重组体的形成：每次分裂中只有一对染色体失去一条染色体单倍体化：指杂合双倍体细胞在增殖过程中基因借助整条染色体的随机交换而得到单倍重组体或单被的亲本分离子

3霉菌准性杂交的的技术：

1选择亲本：选择亲和力强又携带明显营养标记和辅助标记的菌株作为杂交直接亲本

2强制异和：将两个直接亲本的分生孢子或菌丝进行混合接种培养，是两个配对菌株的细胞彼此接触，培养一段时间后涂在MM上

3移单菌落：将MM上长出的单菌落移到含有MM的斜面上

4检验稳定性：检验的得到的菌种是杂合双倍体还是异核体

5促进变异：低剂量紫外诱变

6分离测定

二，酵母菌的有性杂交

1定义：有性生殖：细胞间的接合并产生新的遗传性状的技术

2有性杂交育种的基本过程：1亲本的选择应考虑两个亲本间的亲和性

2形成子囊孢子----接合----杂合二倍体

3孢子杂交：获得杂合子：间亲本接到含NaAc的长孢子的培养基上，分别培养，产生孢子后，用蜗牛蛋白酶或机械法使孢子释放，通过稀释终止酶反应，离心涂在平板上混养

菌种的退化与防治

菌种退化：定义：生产菌种或选育过程中筛选出来的优良菌种由于进行传宗接代或保藏后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减弱或丧失的现象

表现：1目的代谢产物合成能力降低，产量下降

2发酵液中产物组分的改变

3孢子数量减少或增多，生长能力变弱

原因：1基因突变2连续传代3培养和保藏条件影响

菌种退化的防止：1减少传代2经常纯化3创造良好的培养条件4用单细胞移植传代5科学有效的菌种保藏

菌种选育的方法：

1尽量选用单倍体，无单倍体用单核细胞，传代后要经常纯化

2保藏条件

菌种培养的条件：C源。N源的控制

菌种培养措施





菌种的复壮

复壮方法：1、纯种分离，分离后用CMT培养；2、宿主体内复壮法，如根瘤菌；3、

淘汰法，淘汰已衰退的个体

保藏方法

1、低温斜面保藏法，4°下保藏，可保藏3个月；2、沙土保藏法，主要保藏孢子、芽孢；3、也太石蜡油保藏法，1-2CM，室温保藏；4、真空冷冻干燥保藏法



基因重组的概念，奖两个不同个体性状的基因转移到一起，经过重新组合，形成新的遗传型个体 过程，即只生物体在没有发生突变的情况下产生新的遗传型的现象。

杂交育种，认为利用真核微生物的有性生殖（有性孢子）、准性生殖（cell营养体）以及原核生物的转导、转化、F因子等，表达到下一代基因重组的目的。

杂交是cell水平上的基因重组

基因工程师分子水平上的基因重组

基因重组微生物传递的途径

1、两个亲本所有的组分都参与融合，如真核生物的有性生殖和准性生殖

2、通过双亲cell的部分组分接合如原核生物的接合、F因子的转导

3、双亲cell不接触，只有少量遗传性状融合入转导、转化

诱变育种与杂交育种比较

诱变育种，菌种经多次诱变后，可能使菌株死亡，也可能出现菌种退化，方向性较差，且诱变后传代变慢，代谢减弱，产量下降

杂交育种，有方向性，但杂交频率较低，杂交种类很多，筛选比诱变育种难

杂交育种优点

1、通过具有不同遗传性状菌株的杂交，是遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质的基础，扩大变异范围，使两亲株的优定性状集中于重组体内，获得新品种

2、通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅能克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的疲劳效应

3、通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展

杂交育种的器材

1、出发菌株，应具有野生型遗传标记（如营养缺陷行或抗性)与直接亲本不同，一般出发菌株经诱变后成直接亲本，若出发菌株无标记，则重组后无法筛选识别；若出发菌株都为营养缺陷型，杂交后在MM上生长的菌为原养型

2、培养基

1），完全培养基(CM）：营养成分复杂而丰富

2），基本培养基（ＭＭ）：营养成分简单而贫乏

3）有限培养基（ＬＭ）：专供异核体菌株生长使用

4）补充培养基（ＳＭ）：又称鉴别型培养基或选择培养基，是供鉴别重组体类型的培养基

5）发酵培养基：测定杂交菌株的发酵产物的