单增李斯特菌检测技术
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
单增李斯特氏菌及其检测方法
单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。
李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。
其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。
LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。
在血琼脂平板上有β溶血环。
在显色培养基上呈蓝绿色。
2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。
⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
单核细胞增生李斯特菌检测技术是什么
龙源期刊网 单核细胞增生李斯特菌检测技术是什么作者：周林来源：《学习与科普》2019年第31期单核细胞增生李斯特菌包含在食源性致病菌范围当中。
就目前来看，免疫学检测方法和分子学检测方法是很多单增李斯特菌检测方法中使用最频繁的两种方法。
免疫学检测方法具有操作简便、时间短的特点，然而其非常依赖高特异性的抗体，结果容易出现失误，需要对检测结果进行详细判定。
和免疫学检测法相比，分子学检测方法具有灵敏度高、省时省力等特点，然而分子学检测方法在使用过程中需要较多的操作经验，同时不能在大批量检测中应用。
一、单核细胞增生李斯特菌概述（一）生物学特征单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性短杆菌，其对营养的需求量较少，生长温度通常最低不能低于2摄氏度，最高不能超过42摄氏度，同时可以在弱酸、弱碱和6.5%NaCl肉汤中得到快速成长，并且能够形成β-溶血。
在其生长过程中还可以发酵出很多种糖类物质，按照O抗原以及H抗原能够分解成十三中血清型，其中1/2a与4b这两种类型在致病菌株中的占比最大。
（二）污染源及流行病学单核细胞增生李斯特菌是自然界中常见的一种致病菌，抗冻能力非常强，其主要传播路径是通过粪-口这种方式进行。
健康人粪便中的单核细胞增生李斯特菌携带率通常为0.6%至16.0%，然而奶制品、水产品以及家禽中均携带相应的单核细胞增生李斯特菌。
另外，单核细胞增生李斯特菌通过胎盘、黏膜、性以及产道鞥部位都可以进入到体内，从而导致感染。
单核细胞增生李斯特菌的致病性与其具有的毒作用、宿主的免疫状况以及年龄具有密不可分的关系，宿主的细胞免疫可以有效的解除单核细胞增生李斯特菌中存在的病菌。
各种免疫力弱的人群都属于易感人群，比如新生儿、四十岁以上的成人等。
健康成人感染后会出现和感冒相似的情况，然而其他免疫力功能较低的人可能会出现更加严重的症状，乃至会直接死亡。
二、相关检测技术（一）聚合酶链反应技术就目前来看，聚合酶链反应技术得到了广泛的普及与运用。
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
＋
＋
＋
＋/＋
－
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V
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＋
＋/＋
－
V
－
＋
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
食品中单增李斯特菌检测
食品中单增李斯特菌检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。
2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。
基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。
单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。
李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。
此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。
人也可作为无症状携带者。
据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。
李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。
多单在，有时是V字型排列。
无芽孢，不产生荚膜。
在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm 或更长的丝状。
在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。
本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。
对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。
加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。
在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。
在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。
在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。
不形成菌环、菌膜。
在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。
单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展
受到人们的重视 ， 各种快速检测技术也迅速发展。综述了在单增李斯特 菌检 测时基于常规培养 、 分子生物学 、 免疫学 和传感 器的
快速检测技 术 ， 并进行了探讨 。
关键词 ： 致病菌 ； 单核细胞增生性李斯特 氏菌 ； 快速检测
中图分类号 ：９９ Ｑ ３． ９
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：０６ ００ （０ ０—０ １０ １０～ ６Ｘ ２ １）１００— ３ １
开发 完善 新 的快 速检 测方 法 。
患病 ，为典型的胞 内寄生菌 。Ｌ Ｍ广泛存在于环境 中，据 ＷＨ Ｏ报道 ，健康人 的粪便 中 Ｌ Ｍ携带率为
０６ １％， ７ ％的人 可 短期 带 菌 ， 感染 Ｌ 后 ． ％～ ６ 有 ０ 但 Ｍ
引起 的李斯特菌病有高达 ２ ％～ ０ ０ ３％的致死率 ［ １ １ 。 ２０ 年单增李斯特菌被 ＷＨ ０２ Ｏ列 为仅 次于大肠杆 菌 ０１７ 沙 门 氏菌 、 贺 氏菌 后 的第 四大重 要 的食 ５、 志 源性 致病 菌 。
单增李斯特菌的检验方法
单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。
上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。
二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。
（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。
此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。
七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。
李斯特菌检验及快检技术
（Ｍ ＦＬＰ） 的 方 法 、 欧 盟 食 品 安 率 。 快 速 检 测 方 法 主 要 包 括 以 下 三 联 荧 光 分 析 法 （ＥＬＦＡ）、 金 标 免 等 检 测 体 系 大 类 检 测 技 术 。
析 技 术 和 流 式 细 胞 技 术 等 。
ｎ＝５，ｃ＝０，０
６６ ｌ 《质量与认证》２０１５·６
（ＧＢ ４７８９） 和 检 验 检 疫 行 业 标 研 究 和 产 品 认 证 体 系 相 对 成 熟 ， 已 与传 统 方法 的检测 结 果无显 著 性差
准 （ＳＮ） 、 国 际 化 标 准 化 组 织 开 发 出 各 种 快 检 系 统 和 自 动 化 仪 别 。
动 力 试 验 ； 染 色 镜 检 （革 兰 氏染 色 、典 型 运 动 ） ；生 化特 性 （Ｍ Ｒ＿ＶＰ、糖发 酵 ） ；溶 血 试 无 验 ；协 同溶血 ；或生化鉴 定试剂 盒或全 自动微 生
物 生 化 鉴 定 系统
李 斯 特 菌 极 新西 兰 货 架 期 长 的冷 藏 食 品
其 他 即食 食 品
易 污 染 食 品 ， 其 中国香港 冷藏食 品 （冷凝食 品除外）或婴儿食品
０／２５ｇ ０／２５１￣
０／２５ｇ ＜ １ＯＯＣＦＵ／ｇ ０／２５ｇ
不 适 用 不 适 用
中 对 冷 藏 食 品 和 中 国 大 陆 即食 肉制 品
■■＿
——
检 测
Ｔｅｓｔ
『＿］
李斯特茵检验及快 检技 术
文 ／陶 文 靖
一一一一
一一一一
。
菌 髓 生 一
李 斯 特 茵 广 泛 存 在 于 环 境 中 ， 即 食 食 品 的 危 害 最 为 严 重 ， 各 国 在 很 多 食 品 中 均 有 检 出 ，该 菌 在 低 均 制 定 了 食 品 中 李 斯 特 菌 的 限 量
食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测
食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测引言：李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，可以通过食物传播给人类，并引发李斯特菌感染。
李斯特菌感染是一种严重的食物中毒疾病，可能导致严重的并发症甚至死亡。
因此，对食品中的李斯特菌进行分离鉴定及耐药性检测非常重要，以确保食品的安全性。
分离鉴定方法：1. 样本采集：从怀疑被污染的食品中，选择不同部位的样本进行采集，如肉类、奶制品、蔬菜等。
2. 李斯特菌分离：将样本加入到富营养培养基中，在适宜的温度下（37℃），培养16-24小时。
然后将培养液进行测定，寻找典型的李斯特菌菌落。
3. 形态特点观察：通过显微镜观察菌落的形态特征，如形状、颜色等。
4. 生化性质检测：经过形态观察后，选取具有典型形态特征的菌落用于进一步的生化测试，如靶心李斯特菌鉴定板、鲁埃斯鸟氏培养基等。
5. PCR检测：利用李斯特菌特异性基因进行PCR鉴定，以确认是否为李斯特菌。
耐药性检测方法：1. 选择抗生素：选择常见的抗生素，包括头孢呋辛、青霉素、氨基糖苷类药物等，同时也选择一些非常见的抗生素，以探索其耐药性情况。
2. 可兰霉素敏感测试：可通过培养基中加入不同浓度的可兰霉素，观察菌落的生长情况，确定最低抑菌浓度（MIC）。
3. 扩散法：将李斯特菌涂布在富营养培养基上，然后将不同抗生素药片放置在不同区域，观察菌落生长与否。
4. PCR检测：利用PCR方法检测耐药基因的存在情况，进一步确定李斯特菌的耐药性。
讨论：通过以上的分离鉴定及耐药性检测方法，可以有效地检测食品样本中的李斯特菌，并了解其耐药性情况。
应用这些方法，可以及早发现李斯特菌的污染源，并采取相应的措施来控制和预防李斯特菌感染的发生。
此外，这些方法也可为食品监测部门提供参考，加强对食品安全的监管。
结论：李斯特菌是一种严重的食源性病原菌，对人类健康构成潜在威胁。
单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项
单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项嘿，宝子们！今天咱们来聊聊单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中的注意事项呀。
这可相当重要呢！**一、样本采集的注意事项呀**哎呀呀，样本采集可是第一步哇，这一步做不好，后面可就全乱套了呢！首先呢，采集样本的环境得合适吧？要是在那种脏兮兮、乱糟糟的环境里采集，很容易就把其他杂菌也带进来了呀。
比如说，从食品加工厂采集样本的时候，得确保采集的器具都是干净无菌的呢！哇，这一点千万不能马虎呀！还有哦，采集的样本量也要合适呢。
太少了的话，可能就检测不到这种狡猾的李斯特氏菌了呢。
那到底多少才合适呢？这就得根据具体的检测对象来定啦。
像是肉类食品，可能就需要采集足够多的量来保证能检测出潜在的病菌呀！**二、样本运输过程中的注意事项哟**样本采好了，就得运输到实验室去检测啦。
嘿，这运输的过程也有好多要注意的地方呢！温度是个大问题啊！单核细胞增生李斯特氏菌在不同温度下的存活状态不一样呢。
如果温度太高了，细菌可能会大量繁殖或者死亡，这都会影响检测结果的呀！所以，一定要确保运输过程中样本处于合适的温度环境下呢。
那怎么做到呢？哇，可以使用专门的保温箱呀，再加上合适的温度调节剂，像是冰袋或者暖宝宝（如果是需要低温的情况就用冰袋，需要一定温度的情况就用暖宝宝之类的东西啦）。
还有呀，运输过程中要避免样本受到剧烈的震动或者碰撞呢。
要是把样本晃得七荤八素的，细菌的状态可能就改变了呢，这检测结果还能准吗？**三、实验室检测时的注意事项哇**到了实验室啦，这里更是要小心谨慎呢！首先，检测人员得做好自身的防护工作呀。
毕竟李斯特氏菌可是可能对人有危害的呢。
要穿上合适的防护服、戴上手套和口罩哦。
哎呀呀，这可不能嫌麻烦呢！然后呢，在进行检测操作的时候，仪器设备得提前校准呀。
如果仪器不准，那检测出来的结果能靠谱吗？肯定不行啦！在进行细菌的培养、分离等操作的时候，培养基的选择和配制可重要了呢。
要选择适合单核细胞增生李斯特氏菌生长的培养基呀，而且配制的时候各种成分的比例一定要准确无误呢。
单核增生李斯特氏菌检测
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整 齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色， 刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 在0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上， 用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察， 菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
单核增生李斯特氏菌 检测概述
李斯特氏菌属
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类 学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 绵羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克（无害）李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生 李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发 病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李 斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检 测意义的是单核增生李斯特氏菌。
LB和BLB
只有选择性没有区别性
LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、 萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入 的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不 含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 BLB是在LB基础上加入缓冲体系：磷酸二 氢钾和磷酸氢二钠
检测程序---分离
分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX 等。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－ 葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵， 产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而使菌落为 棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性 李斯特氏菌病都能发生这种反应
单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较
Ｃｏ ｍｐ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｔｈ ｒ ｅ ｅ Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｓ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｙ ｔ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ
Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｘ ｕ ａ ｎ ｒ ｏ ｎ ｇ ， Ｙ Ａ Ｎ Ｊ ｕ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｗｅ ｎ ｌ ｏ ｎ ｇ ， Ｈ Ｏ Ｕ Ｍ ｉ ｎ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｖ ｕ ｊ ｉ ａ ， Ｂ Ｕ Ｓ ｈ ｕ ， Ｌ Ｉ Ｇ ｕ ｉ ｍ ａ ｎ
高、 特异性强、 快速高效和低 成本 ， 适合基层实验 室应急检测和现场监测使用。
［ 关键词 ］国标 法； Ｌ Ａ ＭＰ ； Ｐ Ｃ Ｒ； 单核细胞增生李斯特 ． ５ ［ 文献标 志码 ］ Ａ ［ 文章编号］１ ６ ７ ２ — ２ ３ ４ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ — ０ ０ ３ ８ — ０ ５
单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较
张垣榕 ， 颜 军 ， 李文龙 ， 侯 敏， 蒋玉佳 ， 卜 舒， 李桂 满
（ 昆 明市疾病 预 防控 制 中心 ， 昆明 ６ ５ ０ ２ ２ ８ ）
［ 摘 要］目的 ： 通过 比较 国标法 、 ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ 法￣ Ｚ Ｌ Ａ ＭＰ 方法 ， 得 到适合基层 实验 室快速 检测单核 细胞增生李斯特菌的方法。 方 法： 分别用 国标 法 、 ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ法和 环介导 的等 温扩 增（ １ ｏ ｏ ｐ — ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ａ ｌ ａ ｍ ｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｌ Ａ ＭＰ ） 法检测李斯 特菌 ， 并进
ＧＢ ｌ ａ ｗ，ｒ ｅ ａ ｌ － ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ ａ ｎ ｄ Ｌ ＡＭＰ ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｄ ｏ ｐ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ Ｌ Ｍ， ｔ ｈ ｅ ｎ ，ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｅ ｖ ａ ｌ ｕ ａ ｔ ｅ ｄ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ：Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｍｏ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｑ ｕ ｉ ｔ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｎ ｔ ．Ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ＧＢ ｌ ａ ｗ ｔ ｏ ｏ ｋ ５ ｔ ｏ ７ ｄ ａ ｙ ｓ ．Ｗ ｈ ｉ ｌ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ － ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ ｒ ｅ ｑ ｕ ｉ ｒ ｉ ｎ ｇ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｓ ｔ ｔ ｏ ｏ ｋ ２ ． ５ ｄ ａ ｙ ｓ ． Ｌ ＡＭＰ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ， ｒ ｅ ｑ ｕ ｉ ｉ ｒ ｎ ｇ ｌ ｏ ｗ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｓ ｔ ， ｔ ｏ ｏ ｋ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｅ ｔ ｉ ｍｅ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ － ｔ ｉ ｍｅ Ｐ ＣＲ．Ｃｏ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ：Ｔ ｈ ｅ Ｌ ＡＭＰ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｗ ａ ｓ ａ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ，ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ， ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ａ ｎ ｄ ｅ ｃ ｏ ｎ ｏ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｌ Ｍ，
《食品单增李斯特菌检测研究国内外文献综述4300字》
食品单增李斯特菌检测研究国内外文献综述目录1.食品安全问题现状 (1)2.单增李斯特菌存在现状 (2)3.食源性致病菌的检测技术 (3)参考文献 (4)1.食品安全问题现状由于恶劣的自然环境和时间的变化，人类的饮食生活习惯也发生了很大的变化。
食品加工和销售方式也发生了很大的转折和变革，随着我国开展全球性的食品贸易迅猛增长，食品的流通速度加快，然而安全性下降，食物中毒的现象屡屡发生，食源性疾病的患者和发病率也呈现出明显的上升倾向[10]。
无论是发达国家还是在发展中国家，食源性疾病已经极大地损害了人类的身体健康与生命安全，也对经济产生了重要的冲击。
所以，食源性疾病已逐渐成为我们当前必须面对的严峻挑战[11]。
由于受到社会经济效益的驱使，食品企业在生产、销售中屡屡使用各种违规或其他非法的手段。
比如，使用大量的剧毒性农药或者喷洒各种蔬菜、水果等方式进行除虫:或者使用瘦肉精等一些非违禁的激素进行饲养，从而增加瘦肉的产量;随意地使用一个吊白块的方式来添加新鲜的白面粉;把稻草水兑颜料+黄色的带绿勾盐作为酱油卖给企业获利的现象，不胜枚举。
随着企业时代的不断进步和企业改革史的变迁，食品安全企业在批量生产和规模经营这个过程中产品规模的逐步扩大和不断普及以至我国食品安全贸易逐渐逐步呈现走向国际化，世界上所有国家和地区都在不断发生重大食品安全污染事件。
例如，2006年比利时"二嗯英英事件"、英国"疯牛病"、日本的大肠杆菌0157:h7食物细菌中毒[12]，以及被人在我国广泛媒体曝光的安徽阜阳劣质生鲜乳制品("大头娃娃事件")、霉变菌中毒米、苏丹红鸭蛋污染事件、孔雀石虾等绿色海藻鱼虾的排放养殖和其他各类污染事件，都已经逐渐使得我国食品安全突出问题逐渐成为了社会众人广泛密切关注的一个热门话题，再次向人敲响了对我国食品安全领域存在突出问题的重要警钟。
"民以食为天，食以安为先"已成为当今人类对食品质量最基本的诉求[13]。
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CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）
对小鼠有致病性。
定量检测
谢谢谢！
单增李斯特菌编码
2410、2510、2550、6010、 6110、6150、6410、6450、 6510
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液， 用0.85无菌生理盐水制备成浓度为
1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠
我国许多单位也积累了较多的经验，使用最 广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到 各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生 化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI 为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。
API10300
单增李斯特菌API生化结果（6510）
无害李斯特菌API生化结果（7510）
单增李斯特菌检测技术
广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28
李斯特菌属
最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria
monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
培养特性
需氧或兼性厌氧，营养要求不高；
在 22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养 2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。
生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为 35 ℃~37 ℃。
pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长 pH 5.5
按2012食源性致病菌监测工作手册
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌 37℃24h－ 落针尖大小、 48h，2mm灰 形态不典型， 绿色中心黑色 与杂菌难区 凹陷，菌落周 分抑制性强 围呈棕黑色水
解圈
30℃24h－ 48h,2mm灰 黑色菌落周围 呈棕黑色水解 圈
37℃18h24h,蓝色菌 落周围呈白 色晕圈
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。
其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏 李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多 国家和组织的标准采用。
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或 可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管， 于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培 养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培 养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为 黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h(最好是48小 时)，李斯特菌有动力，呈伞状生长。
定性检测 定量检测
定性检测
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。
各个平板上的菌落特征见表
单增李斯特菌在SIM动 力培养基中形成伞状
溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从 TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个 菌落，并刺种阳性对照菌(单增利斯特菌和绵羊利斯 特菌)和阴性对照菌(英诺克利斯特菌),于35℃培养 24h-48h
穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免 琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的 透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特 菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李 斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试 验来确证李斯特氏各种菌。