单增李斯特菌检测技术
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单增李斯特菌检测技术
广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28
李斯特菌属
最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria
monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌 37℃24h－ 落针尖大小、 48h，2mm灰 形态不典型， 绿色中心黑色 与杂菌难区 凹陷，菌落周 分抑制性强 围呈棕黑色水
解圈
30℃24h－ 48h,2mm灰 黑色菌落周围 呈棕黑色水解 圈
37℃18h24h,蓝色菌 落周围呈白 色晕圈
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或 可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管， 于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培 养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培 养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为 黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h(最好是48小 时)，李斯特菌有动力，呈伞状生长。
单增李斯特菌在SIM动 力培养基中形成伞状
溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从 TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个 菌落，并刺种阳性对照菌(单增利斯特菌和绵羊利斯 特菌)和阴性对照菌(英诺克利斯特菌),于35பைடு நூலகம்培养 24h-48h
穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免 琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的 透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特 菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李 斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试 验来确证李斯特氏各种菌。
我国许多单位也积累了较多的经验，使用最 广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到 各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生 化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI 为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。
API10300
单增李斯特菌API生化结果（6510）
无害李斯特菌API生化结果（7510）
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏 李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多 国家和组织的标准采用。
定性检测 定量检测
定性检测
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。
各个平板上的菌落特征见表
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。
其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%
培养特性
需氧或兼性厌氧，营养要求不高；
在 22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养 2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。
生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为 35 ℃~37 ℃。
pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长 pH 5.5
按2012食源性致病菌监测工作手册
单增李斯特菌编码
2410、2510、2550、6010、 6110、6150、6410、6450、 6510
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液， 用0.85无菌生理盐水制备成浓度为
1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂 菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）
对小鼠有致病性。
定量检测
谢谢谢！
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28
李斯特菌属
最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria
monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌 37℃24h－ 落针尖大小、 48h，2mm灰 形态不典型， 绿色中心黑色 与杂菌难区 凹陷，菌落周 分抑制性强 围呈棕黑色水
解圈
30℃24h－ 48h,2mm灰 黑色菌落周围 呈棕黑色水解 圈
37℃18h24h,蓝色菌 落周围呈白 色晕圈
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或 可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管， 于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培 养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培 养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为 黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h(最好是48小 时)，李斯特菌有动力，呈伞状生长。
单增李斯特菌在SIM动 力培养基中形成伞状
溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从 TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个 菌落，并刺种阳性对照菌(单增利斯特菌和绵羊利斯 特菌)和阴性对照菌(英诺克利斯特菌),于35பைடு நூலகம்培养 24h-48h
穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免 琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的 透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特 菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李 斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试 验来确证李斯特氏各种菌。
我国许多单位也积累了较多的经验，使用最 广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到 各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生 化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI 为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。
API10300
单增李斯特菌API生化结果（6510）
无害李斯特菌API生化结果（7510）
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏 李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多 国家和组织的标准采用。
定性检测 定量检测
定性检测
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。
各个平板上的菌落特征见表
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。
其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%
培养特性
需氧或兼性厌氧，营养要求不高；
在 22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养 2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。
生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为 35 ℃~37 ℃。
pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长 pH 5.5
按2012食源性致病菌监测工作手册
单增李斯特菌编码
2410、2510、2550、6010、 6110、6150、6410、6450、 6510
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液， 用0.85无菌生理盐水制备成浓度为
1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂 菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）
对小鼠有致病性。
定量检测
谢谢谢！
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。