单增李斯特菌检测技术
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进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂 菌区分
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）
对小鼠有致病性。
定量检测
谢谢谢！
单增李斯特菌编码
2410、2510、2550、6010、 6110、6150、6410、6450、 6510
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液， 用0.85无菌生理盐水制备成浓度为
1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠
我国许多单位也积累了较多的经验，使用最 广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到 各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生 化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI 为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。
API10300
单增李斯特菌API生化结果（6510）
无害李斯特菌API生化结果（7510）
单增李斯特菌检测技术
广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28
李斯特菌属
最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria
monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
培养特性
需氧或兼性厌氧，营养要求不高；
在 22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养 2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。
生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为 35 ℃~37 ℃。
pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长 pH 5.5
按2012食源性致病菌监测工作手册
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌 37℃24h－ 落针尖大小、 48h，2mm灰 形态不典型， 绿色中心黑色 与杂菌难区 凹陷，菌落周 分抑制性强 围呈棕黑色水
解圈
30℃24h－ 48h,2mm灰 黑色菌落周围 呈棕黑色水解 圈
37℃18h24h,蓝色菌 落周围呈白 色晕圈
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。
其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏 李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多 国家和组织的标准采用。
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或 可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管， 于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培 养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培 养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为 黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h(最好是48小 时)，李斯特菌有动力，呈伞状生长。
定性检测 定量检测
定性检测
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。
各个平板上的菌落特征见表
单增李斯特菌在SIM动 力培养基中形成伞状
溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从 TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个 菌落，并刺种阳性对照菌(单增利斯特菌和绵羊利斯 特菌)和阴性对照菌(英诺克利斯特菌),于35℃培养 24h-48h
穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免 琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的 透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特 菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李 斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试 验来确证李斯特氏各种菌。
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）
对小鼠有致病性。
定量检测
谢谢谢！
单增李斯特菌编码
2410、2510、2550、6010、 6110、6150、6410、6450、 6510
对小鼠的毒力试验 （可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中, 于30℃培养24 h, 离心, 弃上清液， 用0.85无菌生理盐水制备成浓度为
1010cfu/mL的菌悬液, 取此菌悬液进行小鼠
我国许多单位也积累了较多的经验，使用最 广泛的是API 10300, Vitek GNI，考虑到 各种系统在国内的实际应用现状，拟定在生 化鉴定方面“采纳API10300或Vitek GNI 为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。
API10300
单增李斯特菌API生化结果（6510）
无害李斯特菌API生化结果（7510）
单增李斯特菌检测技术
广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28
李斯特菌属
最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria
monocytogenes） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）
培养特性
需氧或兼性厌氧，营养要求不高；
在 22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养 2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。
生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为 35 ℃~37 ℃。
pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长 pH 5.5
按2012食源性致病菌监测工作手册
MMA
PALCAM
OXA
CHROMagar
30℃48h菌 37℃24h－ 落针尖大小、 48h，2mm灰 形态不典型， 绿色中心黑色 与杂菌难区 凹陷，菌落周 分抑制性强 围呈棕黑色水
解圈
30℃24h－ 48h,2mm灰 黑色菌落周围 呈棕黑色水解 圈
37℃18h24h,蓝色菌 落周围呈白 色晕圈
MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。
其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%
该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。
初筛
在我们前期工作中发现，高污染样品在选择 性琼脂平板上可疑菌落较多，为避免漏检和 减少工作量，增加初筛步骤：挑取典型或可 疑菌落接种在木糖、鼠李糖发酵管中，无须 烧环同时TSA-YE平板上划线分离纯菌。
斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增强, 而伊氏 李斯特菌（L.ivanovii）在马红球菌附近的
溶血增强。
商业生化鉴定系统的应用
原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多 国家和组织的标准采用。
初筛及纯培养
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或 可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管， 于37℃培养24h；同时在胰酪胨大豆琼脂培 养基（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃培 养24h-48h。木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为 黄色，在TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色。
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30℃培养24h-48h(最好是48小 时)，李斯特菌有动力，呈伞状生长。
定性检测 定量检测
定性检测
增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。
分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。
各个平板上的菌落特征见表
单增李斯特菌在SIM动 力培养基中形成伞状
溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从 TSA-YE上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个 菌落，并刺种阳性对照菌(单增利斯特菌和绵羊利斯 特菌)和阴性对照菌(英诺克利斯特菌),于35℃培养 24h-48h
穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免 琼脂破裂。 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增 李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺种点周围产生狭小的 透明溶血环，无害李斯特菌无溶血环，伊氏利斯特 菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李 斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试 验来确证李斯特氏各种菌。