实验九 噬菌体效价的测定(张理珉)
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3、噬菌体效价：
指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成 单位（pfu，plaque-forming unit）。
▪ 效价（titre，titer）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）。
二、病毒粒子的构造（模型）
噬 菌 体 的 形 态 及 分 类 科 属
2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单得多，且易获得大量的突变体—— 构建基因文库（λ噬菌体）；基因工程载 体；噬菌体展示技术。
3、细菌感染的诊断与治疗
利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用）
实验九 噬菌体效价的测定
目的要求
1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法 2、观察噬菌斑的形态
实验内容一 培养基和实验物品的准备
本次实验准备工作（2人/组）
1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。
2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 3支/组，分装于18×180mm试管；
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
二、双层平板法
双层平板法（1.ຫໍສະໝຸດ Baidu%琼脂培养基~10mL）
双层平板法
宿主菌悬液（对数期菌液0.9mL）
双层平板法 噬菌体菌悬液（合适稀释液0.1mL）
混匀
37℃ 计数 约4hr
上层培养基（0.8%琼脂培养基~5mL）
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。
▪ 温和噬菌体（temperate phage）
噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。
▪ 针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、 溶源菌
3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%的琼脂）——底层用 ，100ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备6个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，6 支/组； （教师已准备好）
5、1ml无菌吸管 5支/组。
实验内容二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： ▪ 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等
微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 ▪ 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
2、噬菌斑：
在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。
取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-7、 10-8 、 10-9 ）。
4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合
将已加有大肠杆菌敏感菌6皿平板 （ 10-7 、 10-8 、 10-9各2皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
四、噬菌体繁殖（生活周期）
1、吸附 2、侵入 3、增殖（生物合成） 4、成熟装配 5、裂解释放
T4噬菌体吸附和DNA的注入
T
偶
的 扫 描 电 镜 照 片
数 噬 菌 体 感 染 大 肠
杆
菌
T4
噬 菌 体 的 生 活 周 期
T4
噬 菌 体 的 装 配
五、噬菌体的应用
1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补；
②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象；
③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
三、实验原理
▪ 一个噬菌体→侵染宿主细胞→引起裂解 →扩散重复侵染裂解→形成一个噬菌斑 （琼脂凝胶中）
▪ 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量， 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。
七、以防为主的措施：
1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生； 3、决不排放或随便丢弃活菌液； 4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常
进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在 30～40米高空； 5、加强管道及发酵罐的灭菌； 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7、严格执行会客制度。
T4
大 肠 杆 菌 噬 菌 体 结 构 示 意 图
大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 及电镜照片
头部
核心或管 （中空） 尾丝
尾刺或刺突
领环 螺旋形尾鞘
六角形基板
噬菌斑示意照片
噬菌斑
宿主细 菌菌苔
T
大 肠 杆 菌 噬 菌 斑 的 表 型 形 态
三、噬菌体的分类 ——根据噬菌体与宿主菌的相互关系
▪ 烈性噬菌体（virulent phage）
但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。
六、噬菌体的危害
▪ 在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。
▪ 表现形式：①发酵周期明显延长；②碳源消 耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。
▪ 宿主细胞数远远大于噬菌体数？ ▪ 噬菌体效价（pfu/ml）=
噬菌斑数×10×稀释倍数
四、实验步骤
1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培
养基平板6个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌
在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板 上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液 0.9mL。
3、稀释噬菌体
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
▪ 斑点试验法——涂菌平板上滴加稀释液 ▪ 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） ▪ 双层平板法——最常用，相对单层优点较多 ▪ 单层平板法 ▪ 载玻片法——快速 ▪ 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）——滴度表示
指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成 单位（pfu，plaque-forming unit）。
▪ 效价（titre，titer）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）。
二、病毒粒子的构造（模型）
噬 菌 体 的 形 态 及 分 类 科 属
2、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单得多，且易获得大量的突变体—— 构建基因文库（λ噬菌体）；基因工程载 体；噬菌体展示技术。
3、细菌感染的诊断与治疗
利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用）
实验九 噬菌体效价的测定
目的要求
1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法 2、观察噬菌斑的形态
实验内容一 培养基和实验物品的准备
本次实验准备工作（2人/组）
1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。
2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 3支/组，分装于18×180mm试管；
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
二、双层平板法
双层平板法（1.ຫໍສະໝຸດ Baidu%琼脂培养基~10mL）
双层平板法
宿主菌悬液（对数期菌液0.9mL）
双层平板法 噬菌体菌悬液（合适稀释液0.1mL）
混匀
37℃ 计数 约4hr
上层培养基（0.8%琼脂培养基~5mL）
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。
▪ 温和噬菌体（temperate phage）
噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。
▪ 针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、 溶源菌
3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%的琼脂）——底层用 ，100ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备6个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，6 支/组； （教师已准备好）
5、1ml无菌吸管 5支/组。
实验内容二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： ▪ 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等
微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 ▪ 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
2、噬菌斑：
在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。
取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-7、 10-8 、 10-9 ）。
4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合
将已加有大肠杆菌敏感菌6皿平板 （ 10-7 、 10-8 、 10-9各2皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
四、噬菌体繁殖（生活周期）
1、吸附 2、侵入 3、增殖（生物合成） 4、成熟装配 5、裂解释放
T4噬菌体吸附和DNA的注入
T
偶
的 扫 描 电 镜 照 片
数 噬 菌 体 感 染 大 肠
杆
菌
T4
噬 菌 体 的 生 活 周 期
T4
噬 菌 体 的 装 配
五、噬菌体的应用
1、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补；
②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象；
③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
三、实验原理
▪ 一个噬菌体→侵染宿主细胞→引起裂解 →扩散重复侵染裂解→形成一个噬菌斑 （琼脂凝胶中）
▪ 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量， 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。
七、以防为主的措施：
1、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生； 3、决不排放或随便丢弃活菌液； 4、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常
进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在 30～40米高空； 5、加强管道及发酵罐的灭菌； 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7、严格执行会客制度。
T4
大 肠 杆 菌 噬 菌 体 结 构 示 意 图
大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 及电镜照片
头部
核心或管 （中空） 尾丝
尾刺或刺突
领环 螺旋形尾鞘
六角形基板
噬菌斑示意照片
噬菌斑
宿主细 菌菌苔
T
大 肠 杆 菌 噬 菌 斑 的 表 型 形 态
三、噬菌体的分类 ——根据噬菌体与宿主菌的相互关系
▪ 烈性噬菌体（virulent phage）
但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。
六、噬菌体的危害
▪ 在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。
▪ 表现形式：①发酵周期明显延长；②碳源消 耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。
▪ 宿主细胞数远远大于噬菌体数？ ▪ 噬菌体效价（pfu/ml）=
噬菌斑数×10×稀释倍数
四、实验步骤
1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培
养基平板6个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌
在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板 上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液 0.9mL。
3、稀释噬菌体
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
▪ 斑点试验法——涂菌平板上滴加稀释液 ▪ 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） ▪ 双层平板法——最常用，相对单层优点较多 ▪ 单层平板法 ▪ 载玻片法——快速 ▪ 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）——滴度表示