实验七 噬菌体效价的测定

实验七噬菌体效价的测定

杨明轩生物111 1102040128

一、实验目的

1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。

2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

二、实验原理

噬菌体属于细菌病毒，侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑，即为噬菌斑。人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。

噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。其测定常用双层琼脂平板法。由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。

公式为：噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10

（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul 噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验选择的是λ噬菌体EA94，它是一种被改造过的烈性噬菌体。

三、实验材料

1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392；

2、噬菌体：λ噬菌体EA94；

3、培养基：300ml三角瓶中分装100ml LB培养基，15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖；

4、灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装4.5ml 和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；

5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。

四、实验方法

1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌MgSO4·7H20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中，备用。使用前分装至灭菌离心管中，1.2ml菌液/组，保存条件为4℃冰箱保存。

2、噬菌体悬浮液的制备：4℃冰箱保存在缓冲液中的噬菌体0.6ml与活化的处于感受态的E. coli菌体0.6ml混匀，在37 ℃条件下保温25min，使噬菌体吸附到E. coli上。取10块LB平板，每板加入0.1ml混合液并涂抹均匀。在37℃下培养10h。每个平板加入10ml噬菌体缓冲液，将菌及噬菌体洗下。离心后取上清液。进行效价测定预实验。达到所需要求后加1-2滴氯仿，分装为550ul/每组，并置于4℃保藏。

3、制备底层平板：将在50℃左右的LB固体培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml，共9皿（每个稀释度做3个重复）。水平放置，凝固后，做好稀释度标记备用。（作用：1、

提供细菌生长营养物质；2、提供更加平整的平面）

4、噬菌体原液的稀释：取0.5ml噬菌体原液加到4.5ml的噬菌体缓冲液中，得到10倍稀释液，再取0.5ml 10倍稀释液加到4.5ml噬菌体缓冲液中，得到100倍稀释液。以此类推，得到1000倍稀释液。

5、吸附：分别取350μl 10倍、100倍、1000倍的噬菌体稀释液和350μl大肠杆菌原液，充分混匀后置于37℃恒温箱中保温25min，并在离心管上做好相应的标记。（目的：使噬菌体与大肠杆菌充分吸附）

6、制备上层平板：取200μl混合液加入45℃保温的4ml 0.7%琼脂糖，混匀，迅速倒入底层平板，晃动平板，使琼脂糖均匀铺开。勿使琼脂糖凝固成团块！

7、培养：待上层琼脂凝固后，在37℃倒置培养过夜。

8、观察结果，记录噬菌斑的数量。

五、实验结果

记录平板上出现的噬菌斑数于下表1。

表1 噬菌体的效价测定

其中，稀释10倍的平板因为噬菌斑数太多，因此仅计数一个平板以表示数量很多。

但通过对比10倍、100倍、1000倍平板噬菌体效价，发现10板平板效价没有达到预期值（即800左右）。考虑原因主要可能为在操作过程中，对于10倍上层琼脂中加混合液的时候，未待琼脂糖培养液降温便加入了混合液，导致混合液中噬菌体因温度过高而损伤或死亡，导致效价降低。

从数值上来看，稀释100倍得到的结果适中，因此选择这组数据来计算噬菌体原液的效价：

噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10

＝×100×10 pfu/ml＝pfu/ml

六、思考题

测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作？

答：（1）噬菌体与敏感菌混匀后保温时间不能过长，也不能过短。过短造成噬菌体不能充分进入细胞，过长则有可能出现个别细菌细胞先于其他细胞裂解而释放出噬菌体，引起测定不准确。

（2）制备上层平板时，因为琼脂糖很容易凝固，必须做一个倒一个，防止琼脂糖提前凝固干扰实验。

（3）要等上层培养基完全凝固后才可将平板导致培养，防止皿盖上产生冷凝水而干扰噬菌斑的形成和计数。

（4）实验中要多次进行溶液的混合，一定要保证均匀，防止混合不均匀而影响实验结果。

10-1稀释倍数10-2稀释倍数10-3稀释倍数