抗菌肽的作用机制与应用前景

抗菌肽的作用机制与应用前景
王学理1,2,王兴龙1*,刘锴1,2,任林柱1,李晓艳1,梅建军1
(1.解放军军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130062;2.内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽028042)
摘要:各种感染性疾病日益严重地威胁着人类的健康,虽然新的抗生素不断被发现,但是随之而来的细菌耐药性也日益增强,新型抗感染药物的开发日趋显得重要。

抗菌肽是在诱导条件下,由动植物产生的一类分子质量在4 ku左右的免疫多肽。

它
具有较小的分子质量,良好的耐热性和较小的抗原性,且具有广泛的抗菌活性。

某些抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌及抑制癌细胞生长的作用。

因此,抗菌肽有望发展成为一种新型抗菌药和抗肿瘤药物,对人类健康将产生深远的影响。

关键词:抗菌肽;作用机制;应用前景
抗菌肽(antibacterial peptides)广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害,清除体内突变细胞的一类小分子多肽,是生物天然的、非特异性防御系统的重要组成部分[1]。

这种小分子多肽氨基酸数目小于100,常带正电荷[2]。

它们在自然界分布广泛,在动物的免疫细胞、空腔脏器黏膜、皮肤及植物体内均有发现。

自20世纪70年代末从昆虫体内发现抗菌肽以来,已发现300多种这样的内源性抗菌肽,大致可分为4类,即富含Cys残基的defensin(防御素)、富含Pro残基的magainin(蛙皮素)、富含Gly残基的melittin(蜂毒素)和cecropin(杀菌肽)类。

这些抗菌肽具有广谱抗菌活性,同时还有高效的抗真菌、抗霉菌、抗病毒、抗原虫和抗肿瘤活性,是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入侵的重要分子屏障。

研究还发现[3],大多数抗菌肽均是由一个较大的前体作为信号序列,仅会在序列和结构方面作适当的改变,即通过剪切或者加成反应进行修饰,例如糖基化或者卤化。

近年来,随着基因治疗肿瘤暴露出来的诸多问题,人们期望通过研究能够发现替代传统手术及放化疗的新型多肽类抗肿瘤药物,以及不易产生耐药性的新型广谱抗菌药物。

因此,抗菌肽的潜在应用价值受到了国内外学者的广泛关注。

1 抗菌肽的抗菌作用
抗菌肽之所以被冠上“抗菌”这两个字,主要是因为其抗菌谱广,对革兰氏阳性细菌
和革兰氏阴性细菌及真菌[4]、霉菌[5]均有明显的抑杀作用,对一些农作物和经济作物病原菌亦有作用。

高度耐药的伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等对抗菌肽同样敏感。

此外,抗菌肽可以有效杀灭寄生虫,如痢疾、疟疾、cha-gas氏病、利什曼病的原虫等。

另外,有研究表明抗菌肽对流感病毒、疱疹病毒和乙型肝炎病毒等也有抑制作用。

值得一提的是,有报道抗菌肽在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒-1(HIV-1)的基因表达[6],表明抗菌肽对于艾滋病病毒也有抑制作用,这一发现的医学价值是不言而喻的。

在肿瘤治疗方面,大部分化疗药物往往同时抑杀癌细胞和正常细胞,具有较大的副作用。

而抗菌肽能特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长[7],对人体正常
细胞毒性极低,故极有可能成为无毒或低毒副作用的抗肿瘤新药。

抗菌肽的作用对象虽然种类繁多,但其有一共同点,即含膜成分。

所以对病毒而言,抗菌肽只能作用于含包膜的种类。

一般来说,抗菌肽对人体正常细胞是无害的,但也有例外,如蜜蜂毒液中的蜂毒素,毒性就很大。

2 抗菌肽对机体免疫功能的影响
当宿主感染病原菌时,体内抗菌肽的表达量会相应增加,还可以从一些动物模型的试验结果中看到,如牛感染似隐孢菌时,肠防御素含量提高5倍;猪感染沙门菌时,组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)表达量增加3倍;鼠在烧伤部位产生整联蛋白
α8(integrin alpha 8,D4B)防止绿脓杆菌致死效应的发生。

当然,研究者是无法在人体内做试验,但是从一些疾病患者的生理反应中可以看到类似的结果,如感染肺炎球菌的病人,其细胞质中β防御素2(hu-man beta defensins 2,Hbd-2)的表达量增加4倍[8]。

抗菌肽在宿主防御中除了能直接杀死病原菌,还有其他功能;充当单核细胞和T淋巴细胞的趋化因子;使它们能快速聚集在炎症反应部位;促进化
学因子的表达和T辅助淋巴细胞的增殖反应;抑制细菌产物(如脂多糖、脂壁酸)诱导产生对宿主有害的细胞因子,避免内毒素血症的发生;促使巨噬细胞及激活的淋巴细胞的凋亡,也就是指具有潜在消灭感染细胞的功能。

3 抗菌肽的作用机制
目前研究认为抗菌肽可能主要是通过以下机制杀伤肿瘤细胞和微生物。

3.1 形成细胞膜电势依赖性通道
大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构,引起胞内水溶性物质大量渗出,从而最终导致肿瘤细胞和细菌死亡[9]。

其中抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。

抗菌肽在结构上大多具有两亲性α-螺旋,也有一部分具有两亲性β-片层或同时具有两亲性α-螺旋和两亲性β-片层结构。

昆虫天蚕素抗菌肽分子通过其两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上,紧接着抗菌肽分子的疏水段借助于分子中的连接结构的柔性,随即插入到质膜中,之后抗菌肽分子两亲性α-螺旋也插入到质膜中。

这样就打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序。

由于抗菌肽的α-螺旋是亲水和疏水两亲性的,所以最终通过膜内分子间的相互位移,就可以使抗菌肽分子相互聚集在一起形成离子性通道。

因此,细菌失去了膜势,不能保持正常的渗透压而死亡。

防御素作用于细胞膜,通过增加生物膜的通透性而发挥作用。

人工脂质膜的试验显示,防御素作用于膜上形成稳定的通道,且具有依赖电压的传导特性[10]。

尽管防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔,但其分子结构和电生理研究提示,防御素分子能以多聚体的形式作用于胞膜。

有学者基于抗菌肽人中性粒细胞多肽2(human neutrophilpeptide 2,HNP-2)与生物膜疏水区和极性区的作用方式、形成膜孔的大小等,提出由6个防御素分子的同源二聚体组成一个穿孔环的模型[11]。

防御素介导的胞膜损伤与细菌克隆能力的丧失一致,但尚清楚这种胞膜
损伤是否能单独导致肿瘤细胞或细菌死亡,或尚需其他机制如细胞内某些事件的参与。

3.2 抑制细胞呼吸作用
线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。

Fe-hlbaum P等[12]发现,当用40μmoL/L 的thanatin 处理细菌1 h后,可监测到细菌的呼吸作用变弱,6 h后细菌的呼吸作用就会完全停止。

超微结构发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则,核膜界限不清,有的核破裂,内容物溢出。

提示thanatin是通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌的。

Chen Y等[13]也发现抗菌肽tachyplesin的作用机制与抑制线粒体相关的Caspase 7和Caspase 6蛋白有关。

3.3 抑制蛋白质及细胞壁的合成
研究发现[14],麻蝇素Ⅱ(SarcotoxinⅡ)能够抑制细菌细胞壁的形成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,并使细胞壁穿孔,但对已形成的细胞壁不起作用。

3.4 对癌细胞骨架的断裂作用
由于原核细胞和真核细胞的膜结构不同,故抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有特异活性,对正常的真核细胞无作用。

Jaynes等将细胞松弛素作用于哺乳动物细胞以抑制其细胞骨架功能,结果发现经细胞松弛素处理的细胞对抗菌肽的敏感性增加了,说明细胞骨架系统在细胞抵制抗菌肽的溶胞作用上发挥着重要作用。

Chen H M等[15]通过对天蚕素B、B1和B3的研究,发现这3种抗菌肽都可以使体外培养的肿瘤细胞的双分子层发生溶解,微管崩解,肿瘤细胞皱缩、死亡。

由此证实抗菌肽不仅可以使细胞膜发生穿孔,而且还可以通过破坏微管的正常功能,影响细胞骨架的完整性,阻止纺锤丝形成和有丝分裂,破坏细胞器,杀伤肿瘤细胞。

3.5 抑制细胞外膜蛋白的合成
Carlsson A等[16]研究发现,家蝇攻击素(attacins)能够干扰大肠埃希菌细胞外膜蛋白OmpC, OmpF, OmpA和LamB基因的转录,使这些蛋白的含量减少,导致细胞膜的通透性增加,
细菌的生长受到抑制。

3.6 对病原体和肿瘤细胞染色体的影响
Gazal H E等[17]通过对具有同源性的两种抗菌肽dermaseptin S4和dermaseptin
S4(13)的研究, 发现这两种抗菌肽未经处理之前不能与肿瘤的细胞核结合,而经过加工改造后,这两种抗菌肽却具有很强的穿透性,且能结合到肿瘤的细胞核上。

荧光显微镜观察发现,经改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞DNA出现断裂,并导致最终死亡。

由此可断定,抗菌肽对病原体和肿瘤细胞染色体DNA有断裂作用,并且这种断裂作用对癌细胞和正常细胞有选择性,具体原因有待进一步探究。

3.7 诱导细胞凋亡
Mai等以融合抗菌肽DP1局部注射到小鼠实体瘤内,并研究DP1对肿瘤细胞株MCA20凋亡的影响,结果发现DP1可迅速诱导凋亡,并使肿瘤体积缩小。

Chen等
以抗菌肽RGD-tachyplesin作用于前列腺细胞株TSU,以荧光免疫法和Western印迹杂交法检测,结果发现凋亡相关蛋白Caspase 9,Caspase 8,Caspase 3及Fas配体表达均升高,提示抗菌肽RGD-tachyplesin可以诱导与Fas相关的凋亡。

因此,诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一[18]。

目前,抗菌肽作用机制的研究仍在进行之中,严格来说还没有一个定论,尽管以上7种机制存在一定的差异,但形成细胞膜电势依赖性通道被认为是抗菌肽的最主要作用途径。

当然,同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用,了解不同抗菌肽的作用机制,有助于对抗菌肽的临床应用前景及可能产生的问题有充分的认识,使研究开发更具有针对性。

4 抗菌肽的应用前景
现代医学的许多进步都是在抗生素影响下得到发展的。

但是,随着抗生素的大量应用,也使得致病菌的耐药性大大提高。

以青霉素为例,现在青霉素的使用量比最初发现时的使用量增加了几十倍。

更为严重的是,现在还出现了抗生素抗性的超级菌,几乎所有的抗生素对它们都没有作用。

近年来,随着对抗菌肽的进一步了解,人们认识到它是新一代抗生素的理想候选者
[19-24]。

这是因为抗菌肽和常规的抗生素不同,抗生素是通过一系列酶合成的产物,而抗菌肽则是某个特定基因编码的产物。

在杀菌机制上,抗生素一般是通过抑制细菌细胞壁、蛋白质或DNA等的合成来达到杀菌的目的,所以抗生素的抗菌一般是用特殊的受体,细菌容易通过变异对抗生素产生抗性,而抗菌肽的作用机理完全不同于传统的抗生素,它能杀死已产生耐药性的病原菌突变种,而且在使用过程中不易产生具有抗性的突变种。

其次,在病原菌感染中,用抗生素治疗实际上对有机体是有害的,因为它能刺激内毒素的释放,有时还会造成脓毒休克,但使用抗菌肽时就无此现象发生,而且它能抑制细菌产物诱导产生对人体有害的细胞因子。

目前,国内外对利用抗菌肽来研究生产新型抗菌药物倍加重视。

在局部感染方面,已进入临床试验阶段的抗菌肽有乳链菌肽、源于马盖宁的MSI-78及源于猪protegrin的IB-367。

其中MSI-78已进入Ⅲ期临床试验阶段,在对926例患者的治疗中,可明显观察到对糖尿病患者的足溃疡有显著疗效且不良反应小。

IB-367用于治疗癌症患者口腔溃疡,乳链菌肽用于治疗胃溃疡,都已进入Ⅰ期临床试验。

近年来还发现,乳链菌肽的作用位点与万古霉素的作用位点相同,暗示着乳链菌肽有可能成为万古霉素的替代品[25]。

在系统感染治疗方面,人工合成的CAP-18对铜绿假单胞菌引起的腹部感染有疗效。

BPI是人中性粒细胞抗菌蛋白的衍生物,它作为一种注射药物已进入Ⅲ期临床试验,对脑膜炎奈瑟球菌疗效特别显著,试验过程中发现经此药物治疗的儿童患者的死亡率显著降低[26]。

在动植物转基因工程的研究中,美国路易斯安纳州大学的Jaynes实验室与国际马铃薯中心的Dodds合作,已将shiva-1基因转入烟草和马铃薯。

其中转基因烟草青枯病发病明显延迟,病情指数低下,植株死亡率降低。

同样原理获得的抗菌肽转基因动物可明显提高动物的抗病能力。

用腺病毒为载体,将人LL-37基因导入鼠体内,转基因鼠血清及肺中LL-37含量显著增加,
对内毒素及大肠埃希菌抵抗力显著提高。

抗菌肽有着广阔的应用前景。

但是抗菌肽的研究到临床应用还有很多问题需要解决,比如抗菌肽的稳定性和
免疫反应问题,这就要对抗菌肽进行分子改造,使之既能抵抗蛋白酶的分解,又不会在人体内产生强烈的抗原性。

另一方面,抗菌肽进入体内后能否如体外试验一样有效,特别是天然抗菌肽往往来源困难,人工合成价格又非常昂贵。

相信随着对抗菌肽作用机制的不断了解,详细阐明抗菌肽结构和功能的关系后,人们就可以有的放矢地合成新的抗菌肽,为更多的抗菌肽进入临床和其他用途提供机会。