化妆品中苯甲酸、水杨酸、山梨酸、脱氢醋酸及对羟基苯甲酸酯测定 HPLC 法

化妆品中苯甲酸、水杨酸、山梨酸、脱氢醋酸及对羟基苯甲

酸酯测定 HPLC 法

l 适用范围

本方法适用于各类化妆品中苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类、山梨酸、水杨酸及脱氢醋酸的测定。

2 原理

样品经有机溶剂萃取后，经硅胶柱将防腐剂分为酯类和酸类，然后分别注入高效液相色谱柱进行定性和定量。

3 试剂

3.1 防腐剂标准贮备溶液

准确称取100.0mg 苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯、山梨酸、水杨酸和脱氢醋酸，分别溶于甲醇中，并转移至100ml 容量瓶中，定容至刻度。此溶液每毫升含防腐剂1.00mg。

3.2 防腐剂标准应用液

取适量上述各标准贮备液于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使各酯类防腐剂浓度为40μg／m1，水杨酸为80μg／m1。

3.3 硅胶：硅胶60，105℃活化2h，保存于干燥器中备用。

3.4 乙醚：优级纯。

3.5 己烷：优级纯。

3.6 乙醇：优级纯。

3.7 乙睛：优级纯。

3.8 无水硫酸钠：优级纯。

3.9 硅藻土：硅藻土No.545。

4 仪器

4.1 高效液相色谱仪具紫外检测器。

4.2 层析柱：内径2mm、长20cm 的玻璃柱。

5 分析步骤

5.1 样品预处理。

5.1.1 方法1(2)：准确称取样品约0.5g 加约5ml 甲醇及无水硫酸钠5g，充分混合，再加入20ml 甲醇在40℃加热20min，然后放入冰中冷却，以3000r/min 离心10min。取上液（在40℃以下），用浓缩器浓缩，向其均匀散入39 硅胶，并且完全蒸除甲醇(3)，并将其尽可能紧密地放在预先用正己烷+乙酸乙酯（97+3）处理过的含39硅胶的层析柱中，使其尽量紧密。用此混合液将残存在烧杯中的硅胶洗入柱中，接着用正己烷+乙酸乙酯（97＋3）淋洗层析柱，弃去最初流分60ml，然后以1ml/min 的速度+用正己烷+乙酸乙酯（80+20）淋洗。分取液60ml，此液作为淋洗液A，再用甲醇淋洗层析层，分取淋洗液35m1，将此淋洗液作为B(4)。A 及B 溶

液分别用浓缩器（40℃以下）浓缩到约1m1，用甲醇定容至20m1，分别作为样品溶液A 及B。溶出液A 中含有对羟基苯甲酸酯类，溶出液B 中含有其它的酸类防腐剂。

5.1.2 方法(5)

5.1.2.1 化妆水、雪花膏：类准确称取化妆水约10g、雪花膏类约1g 置于烧杯中，加饱合NaCl 溶液50ml，充分混合，转移至200ml 分液漏斗中。加5ml 10％硫酸及50ml 乙醚振荡5min，静置后分取乙醚层，再把水层用50ml 乙醚萃取，合并乙醚层，用50ml 水洗涤，用无水硫酸钠脱水，减压蒸去乙醚。残留物中加40ml 乙腈，移入分液漏斗，用己烷30m1 洗涤2 次后在40℃减压下浓缩至1ml，加乙醇至50.0ml 作待测溶液。

5.1.2.2 粉类：准确取样品2～5g 于50ml 离心管中，加15ml 乙腈，在水浴上加热或用超声波充分均质，冷却后以3000r/min 离心分离10min，用滤纸过滤乙腈层。残渣再用乙腈提取2 次，每次用15min，合并全部萃取液，在40℃减压下浓缩至1m1，再加乙醇至10m1 作待测溶液。

5.1.2.3 牙膏类：准确称取样品2g 于离心管中、加入直径3～4mm 的空心玻璃珠数个， 5m1 水及20ml 乙腈，振荡约l0min。以3000r/min 转速离心10min。残留物每次用乙腈20ml 提取2 次，合并乙腈层，在40℃减压下浓缩至1min，加乙醇至50.0ml 作待测溶液。

5.1.3 方法3（本法适用于含油酯多的奶液和膏霜类样品）

准确称取0.5g 样品，加3g 硅藻土充分混合备用。将2g 硅胶用己烷+乙酸乙酯（95+5）湿法填充在层析柱里，再将样品和硅藻士的混合物填充在硅胶上层，加30ml 己烷+乙酸乙酯（95+5）淋洗(6)，弃去淋洗液。淋洗后，加约30ml 己烷+乙酸乙酯（80＋20）洗脱(7)，流速1.2ml/min，将全部洗脱液移入分液漏斗中，加10ml 乙腈，反复振摇提取二次(8)，取乙腈层在40℃减压浓缩至1m1，用乙醇稀释至10ml。

5.2 色谱条件

色谱柱：TSK，ODS 80Tm5?m，内径4.6mm，长150mm。

流动相：0.05M 磷酸二氢钠+甲醇+乙睛（50+35+15），添加氯化十六烷三甲胺

使最终浓度为0.002mol／L，并用磷酸调pH5.2。

检测器：紫外检测器，254nm（或A 液用254nm，B 液用235nm）。

流速：1.0m1／min。

5.3 定性

将防腐剂应用液用乙醇稀释一倍，取5μ1 注入色谱仪，从所得的色谱图求出各标准防腐剂的保留时间，再取5μ1 样品溶液注入色谱仪，根据出峰时间进行定性。

5.4 定量

5.4.1 标准曲线

分别移取每种防腐剂应用液（3.2）用乙醇稀释，配制成10.0、20.0、30.0、40.0μg／m1（水杨酸为10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg／m1）的标准系列。分别取5.0?1 标准液注

入色谱仪，求出峰高或峰面积，绘制标准曲线。

5.4.2 测定

取5.0?1 待测样品溶液注入色谱柱进行分析，得到各种防腐剂的色谱峰高或峰面积，从标准曲线求得各防腐剂

的浓度A（μg／m1）。

6 计算

c=A×V/m×1/1000

式中：c－一样品中某防腐剂的含量，％；

A――从标准曲线上查得的样品液中某防腐剂的浓度，?g／m1；

V－一样品液总体积，m1；

m 一一样品质量,m1

注解：

(l）5.1.1 方法可以将对羟基苯甲酸酯与水杨酸、山梨酸、脱氢醋酸和苯甲酸分开。适宜对含脂肪的化妆品同时测定酯类和酸类的防腐剂的含量。如只测定对羟基苯甲酸酯类，可以使用5.1.2 和5.1.3 方法。

（2）5.1.1 方法可用见图表示：

（3）残渣中若有少量甲醇残存，加入硅胶，除去甲醇，硅胶则呈分散颗粒状态。如果还有甲醇残留，在烧瓶外侧用干燥器轻轻地加温。因为有甲醇残留，酸类防腐剂有时会在正己烷、乙酸乙酯（80:20）中溶出。

（4）溶出不完全时，再加30ml 甲醇。

（5）主要适用于化妆水、膏类化妆品前处理。此法操作虽然繁琐，但回收率好、能去除干扰物质，不影响柱效。如果用乙腈稀释能得到均一的溶液时，可以直接把样品加到容量瓶中用乙腈定容到50.0m1，作为试验溶液。

（6）用弱极性的己烷+乙酸乙酯（95+5）30ml 进行淋洗，能除去丁基羟基茵香醚（BHA）及才5-2-异丙基酚（IPMP）的干扰。

（7）吸附在硅胶柱上的对羟基氨基酸酯，用30ml 己烷+乙酸乙酯（80＋20）溶出，其溶出率达95％以上。脱氢醋酸等酸性防腐剂仍吸附在柱子上不被溶出，不影响干扰测定。 （8）溶出的对羟基苯甲酸酯用5ml 乙腈萃取二次，回收率达90％；用10ml 乙腈萃取2 次，回收率可达100％。