神经生物学常用研究方法2012

（7）加ABC复合物（avidin-biotin complex) or PAP复合物（ peroxidase-antiperoxidase complex)孵育， 浓度 1:100（或200）。 （8）React with DAB: DAB能致癌，在强光下可氧化（应尽 量避光），6~8分钟出现阳性产物， 镜下控制反应。
常用形态学研究方法
讲授提纲

组织材料的处理 一般染色方法 免疫组织化学 原位杂交 神经细胞培养
I 组织材料的处理
1.固定(fixation)
目的：
防止组织自溶，保护组织免受微生物侵袭，保存 组织成份不被破坏丢失，维持组织结构使之正确 的反应生活状态。
固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定
（2）prehybridization treatment



增强组织的通透性和探针的穿透性： a.稀酸和酸酐(0.2N HCL,0.25%acetic anhybdride)处理： 防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合。 b.去污剂(0.01~0.3%TritonX-100)处理：增强组织的通 透性，利于探针进入组织细胞。 c.蛋白酶(proteinase K)处理:消化包围靶核酸的蛋白质， 使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸 的可及性。
能用NADPH-d组化染色来分析NOS活性。
NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有NOS,但
不能说明有NOS 活性，NADPH-d组化染色阴
性细胞中一般不含NOS.
3.NADPH-d组化染色步骤
a:冰冻切片 b:0.05M Tris缓冲液漂洗 c:于含0.2%Tritonox-100的Tris缓冲液中室温 下预孵育5~10min. d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/ml– NADPH,0.5mg/mlNBT的Tris缓冲液中37℃、 孵育1~1.5小时. e:Tris缓冲液漂洗，中止反应。
40×
NADPH-d Staining In Caudate Nucleus
NADPH-d staining
nNOS-ir
40×
40×
III、免疫组织化学
(Immunohistochemistry)
1.定义：
利用特异性抗体对神经组织中某种特异 成份(抗原)进行抗原--抗体反应,达到检 测组织细胞内是否有此特异性物质.其 本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确 定组织细胞内的某种化学物质).
2.用于尼氏染色的常用染料有： 焦油紫（cresyl violet） 硫堇（thionine） 甲苯胺蓝 (toluidine blue)
3.焦油紫染色法: 石蜡切片或冰冻切片 0.1%焦油紫染液 37℃5-10min 蒸馏水洗 70%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 1min×3次 二甲苯5min ×2次 封片。 结果:尼氏小体紫色，本底无色。
2.切片(section)： 石蜡切片，冰冻切片
II 一般染色方法
一、尼氏染色方法(Nissl staining)：
1. 定义：
是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与 碱性染料结合的主要成份是核酸，神经元胞体中有大量 核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色 质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核 中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏 小体是许多规则平行排列并相互够通的粗面内质网以及 其间的游离核糖体组成。
+
NBT
显色
3.探针的类型
（1）cDNA probe：杂交反应有较高的专一性。因其 为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半 数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则 与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既 重新形成双链）。 （2）mRNA probe（互补的RNA）：为单链结构，杂 交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。 （3）Oligonucleotide probe:由DNA合成仪合成，制 备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组 织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。
（一）HRP Tracing Experiment
1.HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法 2.Survial time：（束路长度 毫米/350毫米）+1日 3.Fixation and Section 4.Incubation Procedure: a.wash sections briefly in three changes of PB b.move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%H2O2) kept at room temperature for 30-40min. c.wash three times in PB for stop the reaction. d.mounting and observation.
2.基 本 原 理
根据碱基互补配对原则：
待测mRNA:
-AGTCTAGT-AGTCTAGT-UCAGAUCAdigoxin
探针(probe):
+
digoxin
-UCAGAUCA-
一定温度、时间与条件
+
digoxin抗体
碱性磷酸酶
-AGTCTAGT-UCAGAUCAdigoxin
碱性磷酸酶
digoxin抗体
NS group
Anti-BDNF group
20×
20×
GAP-43-ir neurons in spinal cord
TH-ir
ChAT-ir
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GAD-ir GABAAR-ir
40×
40×
40×

GFAP revealed with ALEXA FLUOR 488 and S100 beta revealed with ALEXA FLUOR 594 in chicken tangentil vestibular nucleus
5.应 用 与 评 价
（1）应用：
a.用已知抗体探测未知抗原：受体、酶、 递质、 肽类、细胞骨架蛋白等。 b.示踪:示踪物抗体与示踪物反应。 c.用已知抗原探测未知抗体。 d.原位杂交的后续部分。 （2）结果评价: a.有阳性产物，说明细胞内有此物质，但是否由此 细胞产生不能完全肯定。 b.定量:阳性细胞数、 灰度值或光密度值。
（4）Washing:去掉非特异性结合 （5）Incubate in second antibody :浓度 1/100~200,二抗必须针对一抗动物种属， 二抗上结合的物质不同，显色用不同方 法：ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗， 不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非 常敏感，不用DAB做反应，但背景难以 控制。 （6） Washing:去掉非特异性结合
2.NOS与 NADPH-d活性的比较
Nos活性：
a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同 因子结合位点都可抑制Nos b.底物:L-Arg
NADPH-d活性:
a.不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPH b.底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）
NOS活性≠NADPH-d活性,使用NOS抑制剂后不
2.原理
3.Immunohistochemical procedures
（1）Tissue preparation:perfusion,section （2）Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异性结 合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白 （BSA）封闭。 （3）Incubate in primary antibody:最佳浓度需摸索， 为提高抗体向组织内穿透，可在抗体稀释液中 加入0.1%~0.3%TritonX-100。需长时间孵育 时应加入0.01%~0.3%NaN3防腐。 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。

Rat facial motoneurons revealed with three neuronal tracers, blue - fast blue, red - dextran rhodamine, yellow - fluoro gold
四、NADPH-diaphorase组织化学染色法
源自文库 DLG
DRG
Cresyl violet staining
二、高尔基技术(Golgi technique)
The Golgi (and related) methods work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to silver. This produces uniform dark coloring of the whole neuron . The morphology of dendrites and axon can be studied in detail.
GFAP-ir
P75-ir
40X
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IV 原 位 杂 交
(IN SITU HYBRIDIZATION)
1.定义：
原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hybridization)简称原位杂交技术。 是用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测组织细 胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核 酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNARNA杂交和RNA-RNA杂交。
4.Procedures of In Situ Hybridization
（1）Preparation of tissue: a.组织取材：尽可能新鲜，由于组织RNA降解较快， 新鲜组织和培养细胞最好在本30min内固定。取材 时应戴手套，防止外源性RNA污染。 b.固定：4%多聚甲醛，灌注固定时固定剂的用量 一般为动物体重的2倍，浸泡固定时，组织与固定 剂的体积比不低于己于1:10。 C.切片：冰冻切片或石蜡切片。
Cerebellum cortex neuron
cerebral cortex
三、神经束路示踪
1.定义：
利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。
2.示踪剂：
辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP ） 生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA） 神经生物素（neurobiotin） 核黄（nuclear yellow） 荧光金（fluorogold） 固蓝（fast blue）
DRG
Spinal cord
20×
20×
Fast blue labelling neurons
Superior cervical ganglion of the rat showing a vasoconstrictor neuron labelled with Fast Blue injected into the masseter muscle. Section immunolabelled for NPY (green) and calbindin (red)
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
（二）荧光染料示踪法
1.荧光染料的配制：
2.荧光染料的注射：
3.动物存活期：一般存活2-4天。
4.灌注固定、取材、冰冻切片。 5.贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色， 贴片后应立即观察。
1.NO(nitric oxide)的生物合成：
催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO synthase, NOS), NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧为底物，消耗 1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。 NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黄递酶 在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免 疫组织化学染色一致。
4.对照实验
(1)阴性对照： a.NGS 或缓冲液代替一抗 b.去二抗 c.吸附实验：一抗加入后，再加入相应抗 原，将抗体与过量的抗原一起孵育一段 时间后，此混合液再作免疫组化染色 (2)阳性对照：
(3)实验步骤
PBS洗片 0.5%~3%H2O2 15min(灭活内源性过氧 化物酶) PBS洗片 5-10%NGS(或 5~10%BSA)+0.2%TritonX-100 孵育1~2h( 封闭) 一抗4℃过夜 PBS洗片5min ×3次 二抗2~4h室 温 PBS洗片5min ×3次 ABC 1~2h PBS洗 片10min ×3次 DAB显色