枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案一、材料准备（1）实验仪器培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪（2）实验试剂NA培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105（3）培养基配方牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。
二、实验步骤（1）制备菌液称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;（2）进行涂板向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。
（3）菌落计数以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
活菌数的测定方法
活菌数的测定方法
一、直接计数法：
1.显微镜计数法：将样品通过适当稀释后涂布在平板上，然后在显微
镜下直接观察，将显示出的活菌数量进行计数。
2.罗氏计数室法：将适当稀释后的样品放在罗氏计数室中，通过显微
镜下观察菌落数并计数，然后根据稀释倍数计算活菌数。
3.涂布法：将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上，在适宜温度下培
养一段时间，然后观察并计算菌落的数量。
二、间接计数法：
1.白细胞计数法：用白细胞计数板进行白细胞计数，由于白细胞数与
活菌数有一定的相关性，可以通过白细胞计数的结果进行推算。
2.生物标志物法：通过检测样品中特定的生物标志物，如ATP、葡萄
糖等，间接反映出活菌的数量。
3.代谢产物测定法：通过测定样品中的代谢产物（如氧气消耗量、二
氧化碳产生量等），间接推测出活菌的数量。
以上是常见的活菌数测定方法，不同的方法适用于不同的实际应用场景。
在选择测定方法时，需要考虑样品类型、检测目的、测定时间和精确
度等因素。
另外，为了提高测定结果的准确性，还需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养时间等。
最后，需要注意的是，活菌数的测定方法只能提供大致数量，无法直
接得到准确的数值。
因此，在进行活菌数测定时，需要结合其他的检测方
法和数据进行综合分析。
科诺枯草芽孢检测方法
科诺1000亿枯草活芽孢检测方法1.1 鉴别试验根据菌株的生理生化特征，并结合个体形态和群体形态特征，参照《微生物分类学》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株进行鉴定。
见资料性附录A。
1.2 1.0×1011活芽胞/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂芽胞数的测定1.3 枯草芽孢杆菌原药芽孢数的测定1.3.1 方法提要本孢子浓度法用来计算每克枯草芽孢杆菌原药的活芽孢数量。
1.3.2 试剂和溶液稀释液: 氯化钠18g，吐温80 2mL，蒸馏水2000mL，加热充分溶解后分装到5个500mL的三角瓶中，灭菌备用。
营养琼脂培养基与培养皿的制备：蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，NaCl：10g，琼脂粉：15g，蒸馏水1000mL,pH值：7.0-7.2。
灭菌后倒培养皿，备用。
1.3.3 仪器、设备警示:所有器皿必须洁净、无菌；不得使用矿质化的玻璃器皿；移液器具用前需校正。
分析天平：精度0.1mg；立式圆形压力蒸气灭菌锅；恒温培养箱；水浴锅:0-100℃；磁力搅拌器；超声波水浴器；旋涡混合器；中性瓶:250mL；试管: 18×150 mm；刻度量筒: 100 mL；移液枪：100 uL、1000 uL；移液枪头：100 uL、1000 uL；玻璃涂棒；培养皿: 90mm。
1.3.4 测定步骤1.3.4.1 样品的预处理每个样品重复检测3次。
a) 称取0.99～1.0lg(准确至0.0002g)的试样于250mL中性瓶中。
b) 再准确量取100mL稀释液倒入中性瓶中,然后把250mL中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min，之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
c) 将已混合好试样的250ml中性瓶放入超声水浴器中（水浴器的水平面必须等同于试样液面，中性瓶应放在超声波振源处），共超声15min（7min时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8min）。
d) 在超声之后，再次用磁力搅拌混合60min。
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。
以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。
将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。
2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。
3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。
4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。
5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。
同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。
2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。
b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。
c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。
d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。
e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
菌种测定方法
附录 A（规范性附录）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1 原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。
A.2 培养基除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。
A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1 成分营养琼脂 33g；蒸馏水 1000mL。
A.2.1.2 制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.2 酿酒酵母菌培养基A.2.2.1 成分孟加拉红培养基 36.6g；蒸馏水 1000mL。
A.2.2.2 制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.3 植物乳杆菌培养基A.2.3.1 成分蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；灭菌碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。
A.2.3.2 制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.4 麦康凯培养基A.2.4.1 成分蛋白胨 17g；脙胨 3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g；氯化钠 5g；琼脂 17g；蒸馏水 1000mL；0.01%结晶紫水溶液 10mL；0.5%中性红水溶液 5mL。
A.2.4.2 制法A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。
将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。
将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
一种枯草芽孢杆菌的计数方法
一种枯草芽孢杆菌的计数方法说实话一种枯草芽孢杆菌的计数方法这事，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多办法呢。
最开始我想直接用显微镜去数，想着就一个个把那些菌给找出来数清楚。
哎呀，这可麻烦大了。
你知道不，那些枯草芽孢杆菌小小的，看起来都密密麻麻的，而且在显微镜下有时候还会动来动去，我数着数着就晕头转向了，根本拿不准到底数了多少，这个方法失败得一塌糊涂。
后来啊，我又想利用它在培养基上生长形成菌落这个特性来计数。
我就把含有枯草芽孢杆菌的液体样品取了一些，稀释了好多好多倍。
就好比把一碗很浓的粥，兑上好多好多水，变成稀稀的，这样每个细菌就有足够的空间能在培养基上长出自己独立的菌落，不至于都挤在一起分不开。
然后呢，我就小心翼翼地把这个稀释后的样品涂到平板培养基上。
这涂的时候也得小心，就像画画的时候涂颜料，如果涂得不均匀，那长出来的菌落有的地方多有的地方少，计数肯定就不准了。
我把平板放到合适的温度下让它长菌落。
等它长好之后，这又是个麻烦事。
有一些菌落长得奇奇怪怪的，我都不确定那是不是枯草芽孢杆菌的菌落。
这就让我明白啊，要对枯草芽孢杆菌的菌落特征要特别特别熟悉才行。
那怎么熟悉呢？我就专门找了很多标准的图案，自己还分离培养了一堆确定的枯草芽孢杆菌，仔细观察它的菌落大小啊、颜色啊、形状啊这些。
再去数菌落的时候，我还是不敢大意。
我会从左上角开始，然后一行一行地数，这样就能保证不会多数或者少数。
数完之后，因为之前有稀释倍数，还得计算回来，这简单的乘法和除法我都检查了好几遍。
不过呢，我还是有点不确定这个数据到底精准不精准。
毕竟之前在培养的过程啊，稀释的时候可能都有点小误差。
可是就目前来看，这个基于菌落的计数方法，已经是我能想到和做到比较可行的了。
我还听说有一种仪器可以自动计数，但我还没有设备去尝试呢，要是有条件可得试试。
不过当下，就是这种靠显微镜和培养菌落的方法，能多仔细就多仔细，可能就能得到相对准确的枯草芽孢杆菌计数了。
QBHHS JC009-2013 枯草芽孢杆菌活菌计数办法
1检测方法
平板菌落计数法
2
准备材料2.1普通肉汤培养基：试剂名称
添加数量试剂名称添加数量蛋白胨
10克琼脂15g 牛肉膏
5克蒸馏水1000毫升
NaCl 5克配好后高压灭菌倒平板，37℃培养箱置16h（无菌检查），备用。
2.2
0.05％的琼脂生理盐水，高压灭菌2.3
1ml 枪头，高压灭菌2.4
0.2ml 枪头，高压灭菌2.5灭菌的试管
3
试验步骤3.1
向各灭菌试管中加入4.5ml 琼脂生理盐水，每个样品准备至少7支试管；3.2无菌称取0.5g 混匀的新鲜样品，加入到第1支试管，充分混匀后，吸取0.5ml 至第2支试管，同样处理，直到第后一管；
注意：每支试管一定要充分混匀，这是试验成功与否的关键！
3.3分别从最后3管用移液器吸出20μl，再分别滴种到普通肉汤培养基上，每个梯度做三个重复；
注意：一定要从后向前做！
3.4将滴好的平板正置放置30min，使其充分干燥后，再将其拿出置37℃培养箱好氧培养约12h，即可观察结果；
4计数
培养结束后，取出平板，计数每个平板每滴的细菌数量，计算三个重复的平均数，再乘以相应的稀释倍数，即得原样品中的活菌数。
检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC009-2013修订：第1版第1次修改枯草芽孢杆菌活菌计数方法起草：赵丽霞
审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、实验器材准备1.带有盖子的培养皿2.加满蒸馏水的试管3.注射器及针头4.培养基、琼脂、葡萄糖、干燥棉签5.无菌铲子6.无菌尖嘴瓶7.显微镜、移液器、平板振荡器等二、样品的采集和处理1.选择代表性的土壤样品，并在24小时内用无菌探针采集5个不同位置的样品。
2.将每个样品混合均匀，取适量的土壤放入无菌容器准备使用。
三、菌液的制备1.取一个含有褐青素盐琼脂（PDA）培养基的无菌尖嘴瓶，将葡萄糖加入培养基中，按照比例加入适量的样品。
2.将培养基瓶密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，杀死培养基中的已有细菌。
3.灭菌后将培养基倒入带有高度透明度的培养皿中，使其凝固。
四、制备样品的稀释液1.用蒸馏水装满试管。
2.将试管密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，避免试管中的无菌水受到外界污染。
五、稀释菌液1.使用无菌针头在凝固的培养皿上划线。
2.采用无菌技术，将针头刺入活菌样品中，然后点在琼脂上。
3.在培养皿上划线的其他位置也同样操作。
4.将培养皿倒置在25°C温度下放置24-48小时，直到菌落生长到适当大小。
六、菌液的计数1.使用无菌铲子在菌落上刮取一小段。
2.将刮取物重新悬浮在无菌试管中。
3.按照适当的比例将菌液和蒸馏水混合，制备一系列的稀释液。
4.取稀释液的适量放在培养皿中，使其均匀覆盖整个琼脂表面。
5.将培养皿密封并放置在25°C下培养3-5天。
6.在培养皿上观察并计数活菌数量。
七、结果的统计和计算1.统计每个培养皿上的活菌数目，计算平均值。
2.根据样品的稀释倍数、培养皿中的活菌数目和悬液中的总体积，计算出每克样品中活菌的数量。
八、数据记录和分析1.将实验过程中的数据记录清晰，并进行相关的数据分析和比较。
2.结果的可靠性可以通过加入对照组进行验证，确保实验结果的准确性。
九、实验安全注意事项1.在实验过程中要严格遵守无菌操作的原则，避免外界污染。
2.注意实验室卫生，保持实验环境整洁。
枯草芽孢杆菌的检测方法
枯草芽孢杆菌的检测方法1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
1.1恒温培养箱：37℃±1℃。
1.2冰箱：2℃～5℃。
1.3天平：感量为0.1g。
1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。
1.5振荡器。
1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。
1.8无菌培养皿：直径90mm。
1.9显微镜：10倍～100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.11恒温水浴箱80℃±1℃。
2、培养基和试剂2.1 营养琼脂培养基2.1.1 营养琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 琼脂16.0g蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.2营养肉汤培养基2.2.1营养肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 蒸馏水1000mL 2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
2.4.2革兰氏碘液2.4.2.1 成分碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300mL2.4.2.2 制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后再加蒸馏水至300mL。
芽孢杆菌检测方法及注意事项
芽孢杆菌检测方法及注意事项枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项一、检测方法1.试剂和培养基1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，灭菌备用。
1.2 芽孢杆菌培养基：蛋白胨：10g酵母浸粉：5gNaC1盐：10g琼脂粉：15gPH值：7.0～7.2蒸馏水：1000mL分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。
2.检测步骤2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。
b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。
c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min 时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。
e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.2.2样品的稀释a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。
b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。
c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。
冷却至室温后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。
每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。
2.3 涂平板及培养从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。
使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。
混合型饲料添加剂枯草芽孢杆菌的检验操作规程
混合型饲料添加剂枯草芽孢杆菌的检验操作规程Feed grade-Bacillus subtilis1、质量标准来源：NY/T2131-20122、名称：枯草芽孢杆菌3、检验过程3.1、感官：取本品适量，置于非太阳光直射条件下的明亮处，目视检测，本品色泽一致，无发霉变质、结块及异味、异臭。
3.2、粒度：精密称取本品100g，置于0.400/0.25mm金属丝编制筛中，手动或机械振摇10分钟，本品应100％通过0.400/0.25mm 金属丝编制筛。
3.3、水分：取本品1g，精密称定，置于经105℃烘干至恒重的扁形称量瓶中，在105℃条件下干燥至恒重，减失重量应不得过9.0%。
3.5、枯草芽孢杆菌数应≥1×109。
3.5.1、试剂和培养基3.5.1.1、稀释液：0.85%生理盐水经121℃高压灭菌20分钟3.5.1.2、营养琼脂培养基：经121℃高压灭菌20分钟，在无菌条件下注入灭菌后的平皿中，每个平皿约注入15ml培养基。
3.5.2、检测方法：在无菌条件取样25g，置于含225ml灭菌稀释液的锥形瓶中，振摇使样品完全分散于溶液中，即为1:10的稀释液；用移液器或灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，置于含灭菌稀释剂9ml的离心管（或试管）中，密封，摇匀；按上述稀释次序递次稀释至适宜的稀释倍数；取2-3个适宜稀释倍数离心管，用移液器或灭菌吸管吸取0.1ml，接种至营养琼脂培养基平皿上，每个浓度接种两个平皿，使用灭菌后的涂布棒小心涂布接种液于培养基表面，涂布好的平皿盖好后室温静置15分钟，密封并倒置平皿于37±1℃培养箱中培养48±2小时观察。
3.5.3、计数结果：选择30-300个菌落，无蔓延菌落生长的培养皿进行计数，两个平板若其中一个有较大片状菌落生长时，不宜采用，若片状菌落不足平板的一半，另一半菌落生长分布均匀，可计算一半平板的菌落数乘2以代表整个平皿的菌落数。
以同浓度的两个培养皿菌落数平均值乘以样品稀释倍数计算粪肠球菌总数。
芽孢杆菌数量检测
微生物总数检测方法（芽孢杆菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基:配方：以北京路桥营养琼脂为例，按说明上配制需营养琼脂3.3克，水100毫升。
（尽量避免使用牛肉膏蛋白胨培养基）2. 培养条件：温度：33℃-37℃；时间：18--24小时。
二、检测与计数方法1. 梯度稀释取250ml锥形瓶一个，加入适量玻璃珠，100ml无菌水，3滴吐温80（分散剂：分散菌团用），塞上胶塞并放入到70℃水浴锅中预热，待锥形瓶中水温达到70℃后，称取适量样品加入锥形瓶中，摇匀，70℃水浴20分钟。
水浴结束后迅速冷却到30—40℃左右，上旋转式摇床200 r/min充分振荡40 min，即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行梯度稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。
3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1ml (菌悬液加入量)，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数以出现20—300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效菌平均菌落数（x）在20—300之间时，则以该菌落数计算。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：nm = x kv1/(mv2) ×10-8或 nv = x kv1/(vv2) ×10-8（1）式中：nm —质量有效活菌数，亿/gnv —体积有效活菌数，亿/mLx—有效菌落平均数，个k —稀释倍数v1—基础液体积， mLv2—菌悬液加入量， mLv—样品量，mLm—样品量， g重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。
枯草芽孢杆菌实验报告
枯草芽孢杆菌实验报告枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，具有很高的生物活性，对有机物质的分解和土壤健康有重要的作用。
本次实验旨在研究枯草芽孢杆菌的生长和代谢特性，通过定量测定菌落数量和产生抗生素的能力来评估其生物活性和潜在应用价值。
实验步骤：1.枯草芽孢杆菌的培养：取一瓶含有枯草芽孢杆菌的培养基，用无菌环针在琼脂培养基上划线，然后在37°C恒温培养箱中培养24小时。
2. 菌落计数：取一定量的培养基溶液，制备一系列稀释液。
然后，取1ml稀释液分别均匀涂布于琼脂培养基板上。
将琼脂培养基板置于37°C恒温培养箱中培养24小时。
3.菌落计数：取出培养好的琼脂培养基板，利用计数板或显微镜计数室计数菌落的数量。
将每个培养基板上菌落数量相近的三个培养基板进行组合平均，得到最终的菌落数量。
4.抗生素生产测定：取一定量的培养基，加入适当的抗生素敏感菌株。
利用纸片扩散法将培养基涂布于含有抗生素敏感菌株的琼脂培养基板上。
5.抗生素生产测定：将琼脂培养基板置于37°C恒温培养箱中培养24小时。
观察抗生素的形成情况，记录菌落周围的抑制圈直径。
实验结果：1. 菌落计数：测定了不同稀释液下的菌落数量。
结果表明，枯草芽孢杆菌在培养基中的生长有一定的限度。
菌落数量在1:10^-6的稀释液中最多，大约为10^6 cfu/ml。
2. 抗生素生产测定：枯草芽孢杆菌在琼脂培养基中显示出抗生素的生产能力。
抑制圈的直径与抗生素的浓度和种类有关。
枯草芽孢杆菌产生的抑制圈直径在15mm到25mm之间。
实验讨论：1.菌落计数的结果表明，枯草芽孢杆菌在一定程度上受到培养基成分和营养状况的影响，适宜的培养基组分可以促进菌落的生长和繁殖。
2.抗生素生产测定结果表明，枯草芽孢杆菌具有抗生素的生产潜力。
抗生素的生产能力可能与其竞争环境中的营养选择有关。
3.枯草芽孢杆菌的抗生素生产能力对于农业和医学领域具有重要意义。
进一步研究其抗生素成分和抗生素的生产调控机制，可以为抗生素的发现和利用提供新思路。
枯草芽孢杆菌检验方法
枯草芽孢杆菌检验方法《枯草芽孢杆菌检验方法》一、检材收集1.选择霉变的植物组织作为菌源材料，如黄瓜等。
2.采集材料时尽量避免接触空气，少用铁器具，铝器具或木器具等，以防空气中杂菌接触样品。
3.采集材料后立即放入专用密封瓶中，加上10%硫酸铵或20%氯仿液，放入冰箱保存，温度不高于4℃，尽快进行检测，如果检测延期，应将样品冷冻保存。
二、实验注意事项1.穿实验衣时应注意洗手卫生，并用盐酸消毒手部。
2.在操作时必须保持仪器和设备的清洁，并用10%碘酒消毒。
3.在检验中，培养基内的枯草芽孢杆菌不可使用针刺，不可改变培养基中的条件，以便得到较好的定性结果。
4.实验时应注意消毒锥移动，尽量不要对培养基摇晃，以保证实验精准稳定。
5.操作时要保持实验环境的卫生，不允许有杂质进入。
6.在实验中，猪血液培养基、血琼脂培养基、深海水培养基等培养基必须在冰箱内保存，不能被高温污染。
三、实验步骤1.将收集的植物组织放入培养基中，用锥子搅拌，形成悬浮液。
2.将悬浮液过滤后，再按照特定比例加入新鲜糖水液，搅拌均匀。
3.将糖水液的混合物放入玻璃或塑料容器中，逐层培养，注意每层加入新鲜液体，使浓度在每一层保持均衡。
4.将每一层培养液涂布在培养皿中，放入恒温液槽或普通恒温箱中培养，其培养温度为30~37℃，培养时间为24~48h。
5.以血琼脂培养基进行培养，培养结束后根据各菌株的生长情况，判断枯草芽孢杆菌的存在情况。
四、结果判断1.枯草芽孢杆菌的培养结果以清楚的白色斑点或网状斑点作为判断标准，该斑点可发生在培养皿中每一层的表面上，或在培养皿中的深处。
2.如果在检测中发现枯草芽孢杆菌的表面，在下一轮检测时，可以使用更强的抗药材料，以防止对抗药性的增强，或者使用酸性培养基，以防止空气中的杂菌侵入。
3.如果在检验中发现枯草芽孢杆菌的表面，但未形成斑点，可说明该菌原未繁殖，应充分考虑菌株是否抗药性增强及其侵染原因等等。
4.如果在检验中没有发现枯草芽孢杆菌，可能是检材中没有枯草芽孢杆菌，也可能是过量空气、不合适培养条件等原因导致。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
文件名称枯草芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号编制人编制日期年月日颁发部门审核人审核日期年月日印制份数批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
枯草芽孢杆菌分离、培养、纯化
一、菌种提取（1）制备样品稀释溶液称取样品10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散。
用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的土壤溶液。
（2）涂布用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
（3）培养置于37℃温室培养箱，培养24h，固体培养基组成：蒸馏水1L,葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5g,牛肉膏0.5g,琼脂20g二、菌种分离用接菌针挑取单个菌落，接菌到固体培养基。
培养24h。
固体培养基组成同上。
三、菌株生化鉴定1. 革兰氏染色（1）制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
（2）初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
（3）媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。
（5）复染用番红染液复染约2min，水洗。
（6）镜检干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
2. 芽孢染色：改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（1）制备菌悬液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
活菌培养计数检验方法
3.2.9将平皿盖好立刻轻轻摇动均匀，平放于台上，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底朝上，置35±2℃恒温箱内培养。
3.3观察、计数和报告
3.3.1每日观察细菌生长情况，培养至48小时计算最终结果的菌落数。
3.3.2培养到时间后，计数每个平板上的菌落数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每片中的菌落数，进行报告。
有限公司
文件编号
版号
A.0
活菌计数检验法
页次
生效日期
2020/01/02
1．目的
规范及指导生物指示剂（枯草芽孢杆菌菌片）样本中含有的活菌数量的测定。
2．适用范围
适用于菌片活菌数确认。
3．内容
3.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱、刻度吸管(1ml)、PBS(磷酸盐缓冲液)、琼脂培养基
3.2操作步骤
3.2.1每批菌片抽取8个菌片样品试验。
3.3.4.2若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
3.3.4.3若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
3.3.5若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.3.6若阴性对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
3.3.7菌落总数的报告以10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3.3.8菌片活菌数结果以cfu/片为单位报告。
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日期：
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枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
Newly compiled on November 23, 2020
目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程
范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定
责任人：
内容：
1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管
2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：
菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养
18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：
以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
若有两个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算
根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽孢杆菌外的其他菌种）。
统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B）和杂菌数（E）。
有效活菌总数按式（1）计算；
A=10×B×C×5 (1)
式中：
A——有效活菌总数，cfu/g
B——菌落活菌数；
C——稀释倍数。
杂菌率按式（2）计算：
式中：
D——杂菌率，%
E——杂菌数。