反向斑点杂交
反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因
反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民【摘要】目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分别为84.88%、87.10%和79.17%,符合率为97.33%、94.74%和88.37%.结论:膜反向斑点杂交技术是检测部分MTB耐INH、RFP和SM基因型快速、简便的方法.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】4页(P759-762)【关键词】结核分枝杆菌;药物耐受性;反向斑点杂交;聚合酶链式反应;基因【作者】罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民【作者单位】湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004【正文语种】中文【中图分类】R34近年来，我国的结核病发病率和耐药率均有上升趋势，尤其是耐多药结核病和非结核分枝杆菌病及艾滋病并发的结核病的疫情十分严峻，并严重损害着人们的健康。
因此，如何快速、准确地检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)对主要一线药物的耐药性，成为广大学者所关注的课题。
目前临床上检测结核药敏大部分仍延用绝对浓度法和比例法等，其耗时6～8周，结果判定有一定主观性，难以标准化。
Wu等[1]利用反向斑点杂交技术检测利福平(rifampcin,RFP)的耐药基因，准确率达到92.8%，本文作者采用此技术同时检测了RFP、异烟肼(isoniazide,INH)和链霉素(streptomycin,SM) 3种抗结核药物的相关耐药基因，并探讨反向斑点杂交技术与绝对浓度法的相关性。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件
35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。
人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容：5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV）,将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。
若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝色，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显色反应或显很淡的背景色。
5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。
5.3.2 标本采集：5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.2 宫颈脱落细胞:在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。
5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。
5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染标本。
β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
聚合酶链反应-反向斑点杂交法直接从BACTEC-960阳性培养物鉴定分枝杆菌菌种
杂 、 时、 费 准确 度 较 差 ， 以 满 足 临 床 诊 断 和 治 疗 的 需 要 。 难
我 们 以 分枝 杆 菌 ｒｏ 基 因 编 码 序 列 为 靶 基 因 ， 究 建 立 了 ｐＢ 研 聚 合 酶链 反 应 一反 向斑 点 杂 交 法 （ Ｃ — Ｄ ＨＡ） 定 分 枝 Ｐ ＲＲ Ｂ 鉴
合 成。
杆 菌 菌 种 的方 法 ， 感 性 高 ， 测 分 枝 杆 菌 灵 敏 度 为 １ｐ 敏 检 ｇ
Ｄ ＮＡ； 异性 强 ， １种 分 枝 杆 菌 寡 核 苷 酸 探 针 仅 与 结 核 分 特 ２ 枝 杆 菌 复合 群 （ ＭＴＣ 和 相 应 非 结 核 分 枝 杆 菌 （ ＴＭ） 种 ） Ｎ 菌 杂 交 ， 所 试 非 分枝 杆蔺 不 杂 交 ］ 与 。本 研 究 应 用 Ｐ Ｒ Ｒ — Ｃ —Ｄ Ｂ ＨＡ 直 接 对 Ｂ Ｃ Ｉ Ｃ ９ ０阳 性 培 养 物 进 行 菌 种 鉴 定 ， Ａ ＇Ｅ 一 ６ 、 报
山西医药杂志 ２ １ ０ ０年 １月第 ３ ９卷第 １ 期上半 月 Ｓ ａ ｘ Ｍｅ ，ａ ｕ ｒ ０ ０ Ｖｏ ｊ ． ｈ ｎ ｉ ｄＪＪ ｎ ａｙ２ １ ， ｌ ，
！！！ｔ ‘ｓ
・ ５ ２ ・
・
基础研究 ・
聚 合酶 链反 应一 向斑 点杂 交 法直 接从 Ｂ ＴＥ 一６ 反 ＡＣ Ｃ ９ ０ 阳性培 养物 鉴 定分 枝杆 菌 菌种
（Ｍｙ ） 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 （ Ｔ ｂ 、 分 枝 杆 菌 ｐ ｃ、 ｐｕ）鸟
（ Ａｖ） 胞 内分 枝 杆 菌 （ ｉ ｔ 、 萨 斯 分 枝 杆 菌 （ Ｋ ｎ 、 ｐ ｉ、 ｐｎ） 堪 ｐ ａ ） 脓 肿 分 枝 杆 菌 （ Ａｂ ） 瘰 疬 分 枝 杆 菌 （ Ｓ ｒ 、 分 枝 杆 菌 ｐ ｓ、 ｐ ｃ） 胃 （ Ｇ ｓ 、 然 分枝 杆 菌 （ Ｆ ｒ 、 分 枝 杆 菌 （ Ｃ ｅ 、 分 枝 ｐ ａ） 偶 ｐ ｏ） 龟 ｐ ｈ）海 杆 菌 （ Ｍａ ） 猿 猴 分 枝 杆 菌 （ Ｓｍ） 戈登 分 枝 杆 菌 （ Ｇ ｒ 、 ｐ ｒ、 ｐｉ 、 ｐ ｏ ） 苏加 分枝 杆 菌 （ Ｓ ｕ 、 尔 摩 分 枝 杆 菌 （ Ｍａ ） 蟾 蜍 分 枝 ｐｚ） 马 ｐ １、 杆 菌 （ Ｘｅ ） 微 黄 分 枝 杆 菌 （ Ｆ ａ 、 地 分 枝 杆 菌 （ Ｔｅ ） ｐ ｎ、 ｐ ｌ） 土 ｐ ｒ、 耻垢 分 枝 杆 菌 （ Ｓ ） 不 产色 分 枝 杆 菌 （ Ｓ ） 草 分 枝 杆 ｐ ｍｅ 、 ｐ ｍｅ 和 菌 （ Ｐ １ 。引 物 及 探 针 序 列 由上 海 生工 生物 工 程 有 限 公 司 ｐ ｈ）
应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种
应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。
方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。
以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。
结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。
NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。
11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。
结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。
[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。
PCR-反向点杂交法结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变
PCR-反向点杂交法结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变发表时间：2016-05-24T14:39:28.370Z 来源：《医师在线》2016年1月第2期作者：黄丽静陈焯彬李崇建[导读] 广西钦州市第一人民医院 PCR-反向点杂交法是一种能直接快速检测结核杆菌基因突变情况的技术，其特异性强，灵敏度高，适合临床快速检测。
（广西钦州市第一人民医院广西钦州535000）【摘要】目的探究对结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变以PCR-反向点杂交法检测的效果。
方法设计结核分歧杆菌rpoB基因引物，采用PCR-反向点杂交法对40例结核杆菌临床菌株耐药性进行检测，对照由DNA测序法检测的标准结核分歧杆菌（H37Rv）rpoB基因，确定rpoB基因的变异情况，对PCR-反向点杂交法的灵敏度和准确性作出评价。
结果 40株临床菌株中有11株利福平敏感株的基因序列与对照的H37Rv相同，剩下的29株耐药株中检测到变异基因27株，其特异性为100%，阳性率为93.1%。
结论 rpoB基因本身高度保守,但由于rpoB 基因突变导致结核分枝杆菌对利福平耐药。
本研究使用PCR-反向点杂交法针对rpoB基因高突变区设计引物，此方法快速、简便、准确, 能有效监测临床标本中结核分枝杆菌, 对临床早期诊治结核病有极大帮助。
【关键词】PCR-反向点杂交法；rpoB 基因；利福平；结核分歧杆菌结核病是一种由分歧杆菌导致的常见可致命传染病，它不仅能感染并破坏人体对淋巴系统，还能对人体神经系统、泌尿系统、循环系统、皮肤、骨骼、关节等其他部位造成伤害，表现为发热、盗汗、呼吸障碍、咳嗽、咯血、胸痛等，因此，必须及时对结核病进行诊治，防止其对机体造成更大伤害。
利福平（RFP）是临床上治疗结合病的常用药物，但由于结核杆菌常常对其具有耐药性且各地区耐药情况不同，普通的结核杆菌培养耗时较长、过程繁琐，已经不足以满足及时诊治的需求。
PCR-反向点杂交法是一种能直接快速检测结核杆菌基因突变情况的技术，其特异性强，灵敏度高，适合临床快速检测。
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
【原理】
PCR技术原理
DNA的半保存复制是生物进化和传代的重要途径。 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链， 在DNA聚合酶的参与下，依据碱基互补配对原则复 制成同样的两分子挎贝。
PCR技术的根本原理类似于DNA的自然复制过程，其 特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
【原理】
PCR技术原理
【操作步骤】
1.DNA猎取〔已预备好了〕
2.PCR扩增〔承受试总体积25微升
参加 2ul DNA溶液
反响体系各组分的用量见理论课内容
PCR扩增条件
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
PCR由变性--退火--延长三个根本反响步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右肯定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；
②模板DNA与引物的退火〔复性〕：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术承受固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，转变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
反向点杂交 优点
反向点杂交优点
反向点杂交是一种斑点杂交技术，具有快速、简便、高敏感性、特异性强等优点，尤其在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面有其独特的优势。
具体来说，反向点杂交具有以下优点：- 检测效率高：既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型，单次检测标本数量可达96份。
- 性能好：特异性强、重复性好，均高于98%。
- 设备通用：如普通PCR仪和杂交仪，适应于大、中、小型实验室。
- 内部质控：具有真正意义上的内部质控，检测结果更加准确。
- 精确分型：能同时对23种HPV基因型进行精确分型，包括17种高危型和6种低危型。
反向点杂交在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面具有重要作用，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。
反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用
反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用林炳生张太松510080 广州中山大学达安基因诊断中心【摘要】反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。
该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
【关键词】反向斑点杂交；基因诊断Reverse dot blot method and its use in gene diagnosis LIN Bingsheng, ZHANG Taisong. Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,Guangzhou , 510080 China,【Abstract】The reverse dot blot(RDB) method, by using biotine labeled primers, amplify the target nucleic acid and hybridize with the probes covalently bound to the nylon membrane. It can identify several kinds of target sequence in a single assay with reliability and specificity. RDB assay was widely applied to the pathogen identification, gene point mutation assay, genetic polymorphism detection, and provides a promising tool for clinical nucleic acid analysis.【Key words】reverse dot blot(RDB)；gene diagnosis反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。
检测试剂盒反向斑点杂交法
人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书（PCR-反向斑点杂交法）【产品名称】通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB）【包装规格】25人份/盒【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。
【检测原理】反向斑点杂交法本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。
将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。
根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。
加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。
根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。
本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72、81型。
【主要组成成分】【自备试剂】1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。
2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容至200mL，高压灭菌，室温保存。
3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0，定容至1000mL，室温保存。
反向斑点杂交原理
反向斑点杂交原理
反向斑点杂交是一种用于确定DNA序列相似性的分子生物学
技术。
它基于DNA的互补配对原则和碱基对的稳定性。
反向斑点杂交的原理如下：
1. 提取要进行杂交的DNA样品，将其打碎成小片段。
2. 将DNA片段固定到某种固体表面上，例如纸膜或基质。
3. 制备与目标DNA序列相互互补的DNA探针。
探针是已知
序列的单链DNA片段，通常标记有放射性同位素或荧光物质，以便进行检测。
4. 混合探针和标记DNA样品，使其杂交反应发生。
在杂交反
应中，探针与目标DNA序列互补配对形成双链DNA结构。
5. 将杂交反应的混合物进行高温洗涤来去除非特异性结合的DNA片段。
6. 使用影像技术（例如放射自显影或荧光成像）来检测与探针特异性结合的DNA分子。
特异性杂交的DNA分子将在固体
表面上形成可视的斑点。
反向斑点杂交的原理在于，DNA探针通过与目标DNA的互补配对，形成稳定的双链结构。
只有与探针序列高度相似的
DNA片段才能与探针特异性结合，并在固体表面上形成斑点。
这样，通过观察斑点的形成与分布，可以确定目标DNA序列的存在与否，以及DNA序列的相似性。
反向斑点杂交
核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。
固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。
而反向斑点杂交(reverrsedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。
1检测原理反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交。
但是不同于一般的斑点杂交。
一般的点印迹杂交是靶DNA 固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶DNA杂交显色。
这种方法每次杂交反映只能判断待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因(如HLADRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。
而RDB正是解决了这一难题。
RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR 特意性扩增的产物，在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。
这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。
2 RDB检测RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。
同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的Tm值。
反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒
Ｔ ＡＮＧ Ｚｈ ｏ ｕ —ｐ ｉ ｎ ｇ ，ＬＩ Ｌｉ －ｓ ｈ ｕ ，Ｗ ＡＮＧ Ｈｕ ｉ
ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ ｄ ｏ ｔ ｂ ｌ ｏ ｔ ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ ｗａ ｓ ｂ ｕ ｉ ｌ ｔ ． Ｔ ｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｓ ｗ ｅ ｅ ｔ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｖ ｉ ｕｓ ｒ ｓ ｏ ａ ｓ ｔ ｏ
中图分类号 ： ￥ ４ ３ ５ ． ５ １ 文献标志码 ： Ａ 文章 编 号 ： ２ ０ ９ ５ — １ １ ９ １ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ — ０ ０ ４ ３ — ０ ６
Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ Ｐ ＦＭ Ｖ ａ ｎ ｄ Ｓ ＰＶＧ ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ ｄ ｏ ｔ ｂ ｌ ｏ ｔ ｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ
（ 广西农业科学院 经济作物研 究所 ，南宁 ５ ３ ０ ０ ０ ７ ； 防城港市农业技术推广服务 中心 ，广西 防城港 ５ ３ ８ ０ ０ １ ）
摘要： 【 目的 】 以克 隆得 到的甘薯 羽状 斑驳病毒 （ Ｓ ｗ ｅ ｅ ｔ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｆ ｅ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｙ ｍ ｏ ｔ ｔ ｌ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｓ Ｐ Ｆ Ｍ Ｖ） 和甘薯Ｇ 病毒 （ Ｓ ｗ ｅ ｅ ｔ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ Ｇ， Ｓ Ｐ Ｖ Ｇ） 基 因片段为探针建立反 向斑点 杂交 技术 体系 ， 应 用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测 ， 为生产优 质甘薯组 培脱毒苗提供保 障。【 方法 】 根据 已公 布的侵染甘薯 的Ｓ Ｐ Ｆ Ｍ Ｖ和Ｓ Ｐ Ｖ Ｇ 的核苷酸序列设计两对特异引物 ， 以 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 法从染病 的甘薯 叶片扩增Ｓ Ｐ Ｆ ＭＶ和Ｓ Ｐ Ｖ Ｇ的两个 片段 ， 并 以克隆到 的两个 病毒片段及 内参基因Ａｃ ｔ ｉ ｎ 片段 为 探 针建立反 向斑点杂交体 系。【 结果 】 分别克隆 出长度约３ １ ０ 和５ ０ ０ ｂ ｐ 的片段 ， 经Ｂ Ｌ Ａ Ｓ Ｔ ￣对 ， 所获得 的３ １ ０ ｂ ｐ 片段为
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核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。
固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。
而反向斑点杂交(reverrsedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。
1 检测原理
反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交。
但是不同于一般的斑点杂交。
一般的点印迹杂交是靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶DNA杂交显色。
这种方法每次杂交反映只能判断待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因(如HLADRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。
而RDB正是解决了这一难题。
RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特意性扩增的产物，在PCR 引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。
这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。
2 RDB检测
RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。
同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的Tm值。
因此尽可能使设计的探针Tm值变动在较小范围内。
降低了假阳性率和假阴性率。
本法操作安全、简单、快捷，膜条植被时间较短，只需几小时，可大量预先制备放于4 ℃保存待用。
PCR扩增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜(实现了洗膜条件同一化，无需不同洗膜条件)、显色、结果判定。
应用凯普HybrimaxDNA快速杂交仪使整个杂交过程在1.5 h即可完成。
既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。
3 应用范围
由于RDB具有高灵敏性、高特异性和准确性好的特点，目前该项技术已被用于病原体、肿瘤基因检测、病毒基因分型、基因突变以及多态性的研究等多个领域。
3.1 病原体检测
应用RDB可以检出10 ng的细菌DNA，如对肺炎链球菌检出率高、敏感性和特异性都很好［1］。
RDB可用来鉴定临床常见的8种医学真菌［2］。
对沙眼衣原体，在不能得到血清型抗体或者不能进行衣原体培养的情况下来检测标本中存在的衣原体血清型，应用RDB 对衣原体检测是一项简便而有效的技术［3］。
3.2 基因分型检测
国内外常用的基因分型方法包括：限制性片段长度多态性(RFLP)；序列特异性寡核苷酸探针(PCRSSOP)；序列特异性引物(PCRSSP)；单链构象多态性(PCRSSCP)；序列测定(DNASeguence)。
这些方法各有其优缺点。
主要缺点是包括技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率不足。
而RDB却较上述方法显示了其优越性，有广泛的应用价值。
3.2.1 RDB应用于人类白细胞抗原的分型
检测HLA分子的多态性对于移植配型和科研有十分重要的意义［4］。
3.2.2 用于人类乳头瘤病毒(HPV)的基因分型
HPV是已知少数DNA肿瘤病毒之一，在女性下生殖道肿瘤的检出率达到了90％，文献报告有80种左右的基因型，DNA的检测和分型对女性生殖道肿瘤的病因学和癌情预报具有重要意义。
齐风菊等［5］人应用RDB用语HPV常见不同型别的检测，使基因诊断程序大为简化，突现了对HPV的快速诊断。
3.2.3 RDB用于丙型肝炎病毒(HCV)分型
目前HCV主要被划分为6种基因型。
我国主要HCV基因型为1、2、6型，其分布呈南北地域差异，南方以1b型为主，北方以2a型逐步增多，香港有6种。
HCV基因型无论是对HCV的基础研究、临床治疗还是预防，都有着重要意义。
已知HCV可分为11个基因性，80多个基因亚基，HCV基因分型，唯一的参比标准是HCV基因组测序。
RDB技术最大的特点就是简便、快速而分辨能力高，配合凯普快速杂交仪，可同时对多位点多基因序列进行分析。
3.3 基因突变检测
遗传病方面张基增等［6］设计了针对中国人18种突变的ASO探针，建立起检测中国人β地贫突变的RDB法，迄今已成功地应用于40多个家系的产前诊断。
是目前国内多β地中海贫血诊断率最高的方法。
RDB可检测苯丙酮尿症(PKU)是基因突变，PKU主要是由于苯丙氨酸羟化酶的基因突变造成的，PAH的突变不是随机分布的，各型分布的频率与地理位置有一定关系。
RDB对PAH家族的新生儿可快速筛查出来［7］。
RDB用于结核分枝杆菌rpob基因检测，结核分枝杆菌对抗结核一线药物利福平的耐药发生率达90％以上。
rpoB基因内少数密码子突变引起编码RNA聚合酶β亚基构象发生改变，失去结合利福平的能力，而导致耐药的发生。
RDB可以同时在一张膜上检测出覆盖rpoB 基因高频突变区的511位亮氨酸(Len)脯氨酸(pro)，513位谷氨酰胺(G1n)脯氨酸(pro)，516位天门冬氨酸(ASP)缬氨酸(Val)，526位组氨酸(His)天门冬氨酸(ASP)，531位丝氨酸(Ser)亮氨酸(Leu)突变。
RDB用于乙型肝炎病毒(HBV)突变检测，可了解乙肝患者病毒发生变异的状况：如HBVYMDO野生型(株)感染；HBVYIDD型突变型感染；HBVYVDD突变型感染；HBVYMDD 野生型和YIDD突变型混合感染；HBVYMDD和YVDD混和感染；HBVYMDD和YIDD 及YVDD型混合感染。
通过及时了解患者(尤其是拉米夫定治疗者)病毒是否发生突变，有利指导临床用药，如发生突变继续用药无效，不仅增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费，还可能存在严重的流行病学危害［8］。
拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。
近年来报道了Lamivudine治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDDYIDD／YVDD，即在HBVYMDD基因序区发生碱基替化D743或A741G，即Atg，Att／Gtg。
Locarnini等［9］报道认为M552V是拉米夫定耐药突变的主要形式，而有些突变中出了这些碱基突变总伴随着P基因B区的L528M突变，两种突变同时存在可能与M552V和M5521耐药性强弱有关［10］。
HBV感染的临床治疗不能仅限于野生性病毒，详细的病人病毒类型的分子信息显然是很重要的，也是临床个体化治疗实现的基础，对拉米夫定耐药的病人，选用就开发的核苷酸类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效。
文献报告［11］有些突变能进一步导致肝脏疾病，而有些突变可能导致病毒性丧失。
对此值得进一步观测研究。