结核病诊疗进展 李亮

线性探针（Hain）
检测MDR-TB（KatG，InhA；rpoB） 可以检测痰标本 敏感度、特异度：RIF-R: 99%, 99%;INH-R: 94%, 100%;MDR: 99%, 100% 最快5小时出结果；97%的标本在1-2天内出现结果
基因芯片(Genechip)


PLATING OF
MIXTURE IN A PETRI DISH AND OVERNIGHT INCUBATION
Sensor cells
免疫磁珠

原理：粒径在0.5-10μ m之间， 其内核是铁氧体，表面覆盖高 分子惰性材料，如苯乙烯、琼 脂糖等。

裂解液：细菌核酸释放 结合液：DNA与磁珠结合 洗脱液：DNA从磁珠脱离
100000
90000 80000 70000 60000
50000 40000 30000 20000 10000 0
27个高负担国家MDR率
70 60
50
40
30 新病人中 MDR（%）
20
10 复治病人中 MDR（%） 0
治疗成功率：86%
全球发病率、死亡率以及患病率趋势
22个结核病高负担国家结核病发病率（蓝 线）及登记率（黑线）趋势（1990-2009）
MDR-TB中的耐药情况
80
70
60 50 合计 40 30 20 10 0 S（%） E（%） Ofx（%） Km（%）
新病人
复治病人
耐药变化趋势
18.00 16.00 14.00
12.00
10.00 8.00 H R E
6.00
4.00 2.00 45 1990 2000 2007 40 35 30
10
102
103
104
105
106
Poor microscopy (25%) X-ray/clinical only (20%) Culture / PCR (25%) Good microscopy (55%)
← AFB per ml of sputum
Armand van Deun
影像诊断
痰涂片
检测利福平耐药（rpoB） 90分钟出结果 直接检测痰标本
线性探针（Hain）
检测MDR-TB（KatG，InhA；rpoB） 可以检测痰标本 敏感度、特异度：RIF-R: 99%, 99%;INH-R: 94%, 100%;MDR: 99%, 100% 最快5小时出结果；97%的标本在1-2天内出现结果
结核病的流行及诊疗新进展
中国疾控中心结核病防治临床中心 WHO结核病研究培训合作中心 中华医学会结核病学分会
李亮
主任医师
斯大林 费雯丽 肖邦
莫扎特
鲁迅
林徽因
全球结核病的流行

每1秒新发一名病例

每年新出现病人8001000万 每年死亡200-300万

每15秒有一人死于结核


每年接近1％人口感染结 核
完成：16%/年
2030 2040 2050
消灭结核病 （2050）: <1/ 100万
1 2000
2010
2020 Year
我国结核病疫情
WHO（2010年）

我国结核病发病人数130万（发病率96/10万）
涂阳发病人数58万（涂阳发病率45/10万）

我国肺结核报告发病情况（2004～2009年）
2050年结核病控制目标 难以消灭
10000
Propects for TB elimination by 2050
Incidence/100,000/yr
发 1000 病 率 （
1源自文库0
目前：1%/年
1/100 万 ）
计划 6%/年
10
Elimination 16%/yr Global Plan 6%/yr Current trajectory 1%/yr
rpoB/katG/inhA的基因突变（MDR-TB） 菌种鉴定 6小时出结果
以传统药敏试验为对照，应用基因芯片检测耐多药的敏感性、特 异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为76.5%、98.4%、 98.7%、71.4%、84.7%。 每人份约需350元，需1～2天时间，需购买42万元仪器，需在规范 的PCR实验室进行（李亮等，未发表资料）
环介导核酸恒等温扩增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP) 可检测是否感染结核 对涂阴培阳具有非常高的敏感性和特异性 两小时内即可得到结果
PCR

LAMP

需要PCR扩增仪
两条引物 扩增效率:107
不需PCR扩增仪
多对引物保证了扩增的特异 性
γ -干扰素释放试验（Interferon Gamma Release Assays，IGRAs）



原理：淋巴细胞受到结核杆菌特异抗原刺激后释放的 IFN-γ 。 结核杆菌特异抗原：早期分泌靶抗原6 （EAST-6）和培 养分泌蛋白 （CFP-10） 不受卡介苗接种影响。用于结核感染诊断 2010年美国FDA批准：QFT-GIT（QuantiFERON-TB Gold In-Tube test）和T-SPOT 试验（the T-SPOT.TB test）

显微镜观察药物敏感性试验（MODS）

利用倒置光学显微镜和Middle brook 7H9肉汤培养基快速地检测分枝杆菌的生 长。可在1周获得结果
利福布汀耐药浓度研究（黄海荣等）
阴性累计百分 比：在含药培 养基未生长的 菌株累计百分 比。
20 ug/ml可作为利 福布汀耐药界值
箭头所示浓度 为可最大区分 耐药和敏感的 药物浓度。
基因芯片(Genechip)


rpoB/katG/inhA的基因突变（MDR-TB） 菌种鉴定 6小时出结果
以传统药敏试验为对照，应用基因芯片检测耐多药的敏感性、特 异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为76.5%、98.4%、 98.7%、71.4%、84.7%。 每人份约需350元，需1～2天时间，需购买42万元仪器，需在规范 的PCR实验室进行（李亮等，未发表资料）
Phage start to replicate in cells
Actiphage
NEUTRALISATION OF VIRUSOL AND
ADDITION OF SENSOR CELLS
NEGATIVE
POSITIVE
Sensor cells
Sensor cells Sensor cells Sensor cells
60年代以前的标准治疗方案，基于1952年的药物
疗程缩短至6个月 疗程缩短至9个月 疗程为12至24个月
抗结核药物分组（WHO，2008）
组别 组名 药物
第1组
一线口服抗 结核药物
注射用抗结 核药物
异烟肼（H）；利福平（R）；乙胺丁醇（E）；吡嗪酰 胺（Z）；利福布汀（Rfb）
链霉素（S）；卡那霉素（Km）；丁胺卡那霉素（Am）； 卷曲霉素 （Cm）
痰培养

国际公认的结核病诊断金标准 固体培养基：改良罗氏法
液体培养

优点：分枝杆菌生长更好；比固体培养基的阳性率更
高(15-30%)；对非肺部样本和涂片阴性样本,其检出率 更高；报告时间更快(12-14天)；更好和更快的药敏试 验结果(6-12天)

局限性：需要做NALC-NaOH痰处理和离心；污染；价格
高
MGIT 960
BACTECTM MicroMGITTM荧光判读器
指标 敏感度（%） 特异度（%）
判读器 64.59 97.62
MGIT TM 960 65.90 98.79 10 28.47 99.50 44.08
L-J 60.32 97.56 21 23.08 99.46 40.72
结果报告时间 11 （天） 涂阴培阳率（%）29.17 阳性预测值（%）98.99 阴性预测值（%）43.15

1/3人口（20亿）已被或 曾被感染；
全球2009年结核病发病率
2009年全球结核病疫情
病人：940万
TB
死亡：130万
病人：110万
TB
TB/HIV
死亡：38万 MDR-TB 病人：44万
全球结核病患者比例
MDR-TB数量
全球大约85%的MDR-TB 患者分 布在27 个国家
27个高负担国家MDR数量
治疗
治疗方案演变
1950
1946 1952
1960
1963
1970
1970
BMRC 试验 添加R
1980
1974
BMRC试验 添加R和Z 标准治疗方案 2个月：R, H, Z, E + 4 个月：R, H
2005
1998
批准了利福喷 丁
发现了利福 链霉素首次 第一个治疗方案： • 链霉素 平 (R) 用于治疗结 • PAS 核 1961 • 异烟肼 (H) 发现了乙胺丁 醇 (E) 1954 发现了吡嗪酰胺 (Z) – 但产生肝毒性

实时荧光定量PCR (GeneXpert MTB/RIF)
检测利福平耐药（rpoB） 90分钟出结果 直接检测痰标本
•1,730培养阳性患者，发现 92% •S-C+敏感性：单一标本为 72.5%，三个标本为90.2% •特异性： 99%. •利福平耐药：敏感性 99.1% •排除：特异性100%
第五次全国结核病流行病学抽样调查

15岁及以上肺结核患病率：459/10万 传染性肺结核患病率： 66/10万
MDR-TB与XDR-TB



MDR-TB率为8.32%。其中，初治涂阳为5.71% ，复治涂阳为25.64%。 XDR-TB率为0.68%，其中初治为0.47%，复治 为2.06%。 估算全国每年新发MDR-TB患者12万例；其中 初治7.4万例，复治4.7万例；每年新发1万 XDR-TB患者
病例类型 肺结核 肺外结核 非结核
T-SPOT-TB 阳性率（%） 61.1 69.2 17.0 强阳性率（%） 44.4 30.8 6.4
对涂阴患者诊断有帮助
肺结核诊断
Diagnosis of Pulmonary TB Related to Numbers of Tubercle Bacilli
120
肺结核
100 发 病 80 率 （ 60 1 / 1 40 0 万 20 ） 0 2004年
菌阳
96.3 85.8 74.6 88.6 88.5 81.1
41.8 33.8 27 32.9 33.4
36.3
2005年
2006年
2007年
2008年
2009年
不同机构对肺结核患者发现的贡献(2009)
POC（point-of-care）：及时诊断技术

简单 快速 方便 最大可能发现患者

volatile organic compounds (VOCs)：挥发性 有机化合物

lipoarabinomannan (LAM)
耐药结核病诊断
实时荧光定量PCR (GeneXpert MTB/RIF)
扩增效率:1010

噬菌体
• 分枝杆菌噬菌体可感染相应的活的分枝杆 菌。若临床标本中含有相应的分枝杆菌， 噬菌体可侵入菌体内进行大量繁殖，最终 裂解菌体，释放出噬菌体感染指示细胞， 并使指示细胞裂解，在琼脂板上出现噬菌 斑。
• 利福平耐药性检测
• 2天内即可出结果 • 无需特殊设备 • 成本低
TB bacilli INFECTION TREATMENT WITH VIRUSOL
复治
0.00
初治
25 20 15
H
R E
10
5 0 1990 2000 2007
TB/HIV

TB/HIV双重感染者：31.2万
TB/HIV病人：2.1万 结核病人中检出艾滋病：0.8% 艾滋病病人中检出结核：13%
治疗转归
结核病细菌学诊断
结核杆菌感染诊断
PPD
历史
1890：Koch Old Tuberculin 1910：Mantoux intradermal test 1934：Seibert PPD-S 1951：PPD-S WHO standard 受到卡介苗接种、自身免疫反应、合 并疾病、年龄等因素影响，结果解释 困难 PPD-Rt23：丹麦制品第23批
作用：病例发现、疗效判断、疫情评估、规划实 施效果的评价


经济、简单、快速、易行 方法：萋尼氏染色 荧光染色
二极管发光荧光显微镜(LED)

光源寿命：3万小时（15年） 不需暗室 不需预热 现有显微镜改造 电池


初诊患者：LED涂阳患者检出率为14.96%，萋尼氏染色明场显微镜涂阳 患者检出率12.46%（P=0.000） 读片时间：LED 读片时间120.03±38.88秒，普通显微镜 206.31±75.86秒（p=0.00） （致谢：赵雁林）