流式细胞仪检测常用试剂配制

流式细胞仪检测常用试剂配制1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)

贮存液(10×)：

80.2g NH

4

Cl (1.5M)

8.4g NaHCO

3

(100mM)

3.7g EDTA Na2(10mM)

蒸馏水900 ml

调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)

加蒸馏水至1升

4℃保存6个月以内

工作液(1×)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存

注: 1) 贮存液不可小于10×, 否则会形成碳酸铵而失效

2) NaHCO

3可由10g KHCO

3

替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代

3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即 1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na4

2．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制

0.23 g NaH

2PO

4

(无水; 1.9 mM)

1.15 g Na

2HPO

4

(无水; 8.1 mM)

9.00 g NaCl (154 mM)

加蒸馏水至 900 ml

若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4

过滤除菌, 4℃保存

注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.3

2) 有些实验室将PBS配成 10×浓缩液, 用时稀释

3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制

0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65℃. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml

10× PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.

注: 4℃可保存2周

4．用氯化铵溶血剂的溶血方法

1)100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀

2) 避光孵育10~15分钟

3) 离心, 去上清, PBS洗2次

4) 抗体染色后, PBS洗

5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2℃-直至上机检测

5．血小板活化检测

1. 先固定后染色

1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做

20tests)

2) 2℃-8℃固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)

3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟

4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬

5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟

6) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时

2. 先染色后固定

1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟

2) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2℃-8℃避光30分钟, 但不可超过24

小时

注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用

2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行

3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,

造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定

4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：

¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。先弃除最初的2mL 血, 然后再采4.5mL血入含0.5mL 3.8%柠檬酸钠的抗凝塑料注射器内

¨ 采血后1分钟内, 将5ml血加入含50mlPBS和适量抗体的标本管中, 孵育

15分钟

¨ 500ml PBS稀释, 上机检测

6．PI染液配制

生理盐水 32.4ml

PI 2.5mg

Rnase 0.5mg

Triton-X-100 0.25ml

枸橼酸钠 50mg

加蒸馏水至 50ml

4℃避光保存数月

染色方法: 106细胞中加入1ml PI染液, 避光染色至少30 min, 上机检测。

7．TO染液配比方法

甲醇 1ml

TO 1mg (储存液)

储存液至工作液

储存液用PBS 1：1000稀释

染色方法：5ul全血+50ul TO工作液染色20分钟 PBS复容至1 ml上机检测阴性对照5ul全血+1mlPBS