GBT22388奶粉中的三聚氰胺检测液相色谱质谱法
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。
三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。
本文参考了以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。
1 实验部分1.1 仪器与试剂LC1600高效液相色谱仪（含UV1600紫外-可见检测器1台，P1600高压恒流泵1台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。
1.2 标准品溶液配制精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
1.3 样品前处理称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。
取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC 测定溶液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm)流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min波长：240nm温度：40℃进样量：20μl2 实验结果2.1 精密度实验取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.57％。
三聚氰胺奶粉检测方法
三聚氰胺奶粉检测方法
三聚氰胺奶粉检测方法如下：
1. 离子色谱法：该方法基于三聚氰胺在水中形成氢氧化铵和靛酚蓝络合物的反应，在离子色谱柱中用硫酸为流动相进行分离，再通过紫外检测器进行检测。
2. 高效液相色谱法：该方法使用高效液相色谱柱进行分离，以甲醇和水为流动相，以紫外检测器和荧光检测器进行检测三聚氰胺。
3. 液质联用法：该方法是高效液相色谱法和质谱法的结合，可以同时分离和定量三聚氰胺及其代谢产物。
4. 岛式红外光谱法：该方法利用不同样品的红外光谱图谱的差异性来鉴别含三聚氰胺的奶粉。
5. 快速检测法：该方法使用荧光和拉曼光谱等技术，可以在几秒钟内快速、准确地检测奶粉中的三聚氰胺。
以上是常用的几种三聚氰胺奶粉检测方法。
不同的方法具有不同的优点和适用范围，可以根据实际需求选择合适的检测方法。
高效液相色谱HPLC法测定三聚氰胺成分含量
高效液相色谱法测定奶制品中三聚氰胺1引用标准按照国家标准GB/T 22388-2008，三聚氰胺简称三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料。
因三聚氰胺分子中含有大量氮元素，一些不法厂商通过添加这种化工原料，提高产品中蛋白质含量。
2方法原理：采用HPLC法测定三聚氰胺，成本低，不需要衍生，简便易行。
采用外标法进行定量分析。
本方法采用南京科捷LC-600二元高压梯度，按照国家标准GB/T 22388-2008对牛奶中三聚氰胺进行检测。
该方法稳定可靠，检测范围广泛。
3. 仪器和试剂LC-600二元高压梯度系统：输液泵，配梯度单元和在线脱气装置；LC-600紫外检测器；手动进样器7725i，色谱工作站N2000P,离心机1台（转头6*50ml）；固相萃取小柱和萃取装置；氮吹仪；三聚氰胺对照品购自sigma公司，样品液态奶购买于超市，实验中用到的其他试剂如三氯乙酸、氢氧化钠、柠檬酸和辛烷磺酸钠均为分析级。
4. 色谱条件色谱柱：V enusil ASB-C18 4.6×250mm （也可选用C8柱）缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM辛烷磺酸钠流动相：缓冲溶液:乙腈=90：10进样量：20uL流速：1.0mL/min柱温：40℃5. 样品制备按照GB/T 22388-2008中3.4节进行：称取2g（精确到0.01g）试样（液态纯牛奶）于50mL 具塞塑料离心管中，加入15ml 1%三氯乙酸提取液和5mL乙腈，充分混匀，超声提取20min，再振荡提取10min后，以4000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，过混合型阳离子固相萃取小柱(PCX)。
洗脱液于50℃下氮气吹干，残留物用20%甲醇的水溶液定容至1mL。
6. 定性分析称取三聚氰胺标准品适量，流动相溶解，按照上述色谱条件，进入色谱仪分析。
保留时间分别为4.75min。
7. 样品测试按照上述样品处理方法和色谱条件，对样品进行测定，得到色谱图如图1所示。
三聚氰胺含量测量不确定度分析 GBT 22388-2008
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
3.2标准系列浓度-峰面积拟合直线求得C产生的相对标准不确定度
标准系列浓度—峰面积拟合直线求得u’2(C)=u2(C)/C，每个浓度分别进样2次，根据公式Aj=CjB1+B0线性最小二乘法拟合，求得B0、B1，结果见表2。
表2三聚氰胺标准系列峰面积测定结果及拟合方程
项目
浓度C
（mg/l）
峰面积A
1
2
平均值
三聚
氰胺
0.0
0
0
0
2.0
173604
174048
173826
4.0
346195
345521
345858
8.0
662178
661356
661767
16.0
1326655
1327584
1327120
20.0
1674771
标准溶液配制及稀释过程引起的相对合成标准不确定度
= %
=0.661%
表1量器容量允差表
规格（ml）
容量允差值（A级±ml）
相对标准不确定度
2Байду номын сангаасl单标吸管
0.010
0.289%
10ml刻度吸管
0.05
0.289%
10ml刻度吸管
0.05
0.289%
25ml刻度吸管
0.10
奶粉中三聚氰胺含量测定——实验步骤
高效液相色谱(HPLC-UV)法测定奶粉中三聚氰胺的含量一、实验目的：测量奶粉中三聚氰胺的含量是否达标。
二、仪器：高效液相色谱仪，离心机，固相萃取装置，柱温箱，紫外检测器，C18柱，超声波清洗器，pH 计，电子天平，氮气吹干仪，涡旋混合器；5mL移液管1支,1mL刻度移液管1支，25mL容量瓶1个，100mL容量瓶6个，100mL烧杯1个，微量进样器一支。
三、试剂：三聚氰胺标准品，1%三氯乙酸，氨水，柠檬酸，庚烷磺酸钠（色谱纯），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），二次水，甲醇水溶液（准确量取50mL甲醇和50mL水，混合备用），5%氨化甲醇（量取5mL氨水和95mL甲醇混合备用），离子对缓冲溶液（准确称取2.10g柠檬酸和2.02g 庚烷磺酸钠加水溶解后调节pH=3，定容至1L备用），三聚氰胺储备液（准确称取100mg三聚氰胺，在100mL容量瓶中用甲醇水溶液定容），净化柱（固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯），氮气。
四、实验步骤：1.样品预处理：准确称取2g样品，用10mL 1%三氯乙酸溶解后转移至25ml容量瓶中，乙腈定容。
超声提取10分钟后离心，干过滤。
用5mL移液管准确移取5mL过滤后的溶液过净化柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤并抽干后后用约6mL 5%氨化甲醇洗脱。
洗脱液用氮气吹干后用1mL流动相定容，涡旋混合1分钟后经0.20 μm有机相滤膜过滤后进样。
2.色谱条件：C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以离子对缓冲溶液+乙腈（85+15）作为流动相，流量为1.0 ml/min，柱温为35 ℃，检测波长为240 nm，进样量为20 μl。
3. 标准曲线的绘制：将三聚氰胺标准储备液（1.00×10^3 mg/L）用甲醇-水溶液（1+1）逐级稀释得到浓度为1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的标准系列溶液，以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线。
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。
三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。
本文参考了以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。
1 实验部分1.1 仪器与试剂LC1600高效液相色谱仪（含UV1600紫外-可见检测器1台，P1600高压恒流泵1台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。
1.2 标准品溶液配制精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
1.3 样品前处理称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。
取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC 测定溶液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm)流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min波长：240nm温度：40℃进样量：20μl2 实验结果2.1 精密度实验取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.57％。
三聚氰胺鉴定
5然放规的色中然加三实0于m后置格比管，后入氯验L 流1（2程乙铅在声态持5m液5m酸溶超状下续L%，L），
乙酸 溶液
15mi n，
混合 后， 将样 品放 置到
50mL 离心 管中， 采用
PCX 固相 法进
3mL 水，
3mL 甲醇 进行 淋洗 后，
20m mHg 柱压 力条 件下 持续
3min
洗脱 液在
◦ 测得的三聚氰胺的回收率 为 92% ～ 108% ，表明了本方法适用于奶粉对此三聚氰胺检测，具有较好的应用 前景。
实验过程
纳米金溶 胶的合成
三聚氰胺 检测平台 的构造
三聚氰胺 的检测
拉曼光谱 信号的采
集
实验结果
实验结果
结果讨论
◦ 在相同的 实 验 条 件 下，对此三聚氰胺检测体系的选择性进行评估。分别向检测体系中加 入 100 μmol /L 的维生素 C、NaCl、葡萄糖、乳糖、CaCl2、NH4Cl、赖氨酸、KCl、三聚氰酸溶液和 1 μmol /L 的三聚氰 胺溶液，一定时间后进行拉曼测试。以 I715 /I1076 的值为纵坐标作图。由表 1 可知，在干扰物质 的浓度为 三聚氰胺浓度的 100 倍时，三聚氰胺的 I715 /I1076 值明显大于其它几种物质。虽然某些干扰物 质能够引起 纳米金的聚集，但是这些干扰物质的拉曼散射峰不在 715 cm!1 处，不会对 I715cm /I1076cm 的值 产生较 大的影响; 在几种干扰物质中，三聚氰酸对此检测平台的干扰最大，因为三聚氰酸与三聚氰胺的 化学结构式 相似，六元杂环的原子组成相同。但是，三聚氰酸与三聚氰胺的杂环碳原子上连接的官能团 不同，因此，三 聚氰酸与三聚氰胺的六元碳-氮杂环的环呼吸振动模式的拉曼散射峰的位置不同，所以， 体系中的三聚氰酸 不会对三聚氰胺的检测产生重大的干扰。综上所述，本研究构建的三聚氰胺 SEＲS 检测体系具有较高的选择 性。
高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的含量
实验结果及判定
按照上述步骤进行检测，得出实验结论，如： 在符合要求的条件及规范的操作步骤的前提下， 经检验该样品的三聚氰胺含量为6.90mg/kh
根据GB/T 22388-2008规定，该样品三聚氰 胺含量6.90mg/kg，大于规定的2mg/kg,产 品不及格。
结论与反思
检测是手段，乳制品的质量安全才是最终的目的。 一旦发生食品质量安全事故，首先受害的是消费者。 在受到伤害的情况下，消费者对食品质量安全事故做 出的第一反应就是拒绝继续消费问题产品。于是就造 成了一系列的食品安全“伤害效应”，表现为对消费 者的伤害效应，对加工企业和奶站生产的伤害效应和 对广大奶农产生了伤害效应。 在总体上看，我国的奶业在农业中依然是一个发展 相对滞后的产业，牛奶的人均占有量和消费量都显著 低于世界平均水平，与发达国家的差距更大。要缩小 我国奶业与世界及发达国际的差距今后的道路还很漫 长，任务还很艰巨，需要以科学发展观为指导，把我 国奶业引向健康发展的道路。当前我国奶业所面临的 体制、机制以及技术层面的问题有很多，需要长期努 力逐步加以解决。
LOGO
三聚氰胺标准溶液的液相色谱图
7.401 4 6
mAU 1.6 1.4
三 聚 氰 胺
1.2
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 8 10 mi n
定性鉴定与定量分析
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范 围内，超出线性范围则应稀释后再进样分析。
两次进样图谱
第一次进样
第二次进样
LOGO
测定奶粉中三聚氰胺的含量 ——高效液相色谱法
生物工程1001班
目录
1 2 3
三鹿毒奶粉事件
液相色谱法简介 样品检测方案
高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的分析
2009.6D a i r y I n d u s t r y □ 乳品加工奶酪中的钙、磷的营养亲密度分别为1.3~7.0以及2.6~5.7（表5）。
从表5中可以发现，同一种类的奶酪，其脂肪含量越高，钙、磷的含量越低；而使用凝乳酶生产的奶酪中，钙含量通常要高于用酸法生产的干酪。
干酪中的钙、磷以及其它矿物质元素可被人体利用，这一点和乳中的这些矿物质元素没有区别。
奶酪的生生素也都进入了凝乳，相反，大部分水溶性维生素都在凝乳过程中随着乳清析出而排出（表6）。
2 结论奶酪营养成分丰富，主要为蛋白质和脂肪，其脂肪和蛋白质含量较原料奶中的蛋白质和脂肪提高了10倍。
此外，所含的钙、磷等无机成分，除参考文献[1]Walstra P . Dairy Technology.New York ：Marcel Dekker Inc,1999[2]张和平，张列兵. 现代乳品工业手册（第一版）. 北京：中国轻工业出版社，2005[3]郭本恒.奶酪. 北京：化学工业出版社，2003[4]董幕莹，任发政.世界干酪文化鉴赏. 北京：化学工业出版社，2004[5]郭本恒.现代乳品加工学. 北京：中国轻工业出版社，2001[6]赵新淮，于国萍，张永忠，李铁晶. 乳品化学. 北京：科学出版社，2007■ 孙宇霞 呼伦贝尔市产品质量计量检测所【摘要】本文采用国家标准法中高效液相色谱法检测了乳及乳制中的三聚氰胺，经过反复使用和多次试验，从样品处理、净化、仪器测定3个方面，对国家标准中要求不详之处，进行了补充和改进。
对用液相色谱法检测三聚氰胺所用色谱柱和流动相进行了优选，将乳及乳制品中与三聚氰胺出峰时间重叠的组分进行了完全分离。
关键词：高效液相色谱法；三聚氰胺；检测分析高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的分析在“三鹿牌婴幼儿奶粉事件”发生后，国家标准化管理委员会紧急启动了标准制定程序，开展了原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法研究[1]，在第一时间制定并颁布了国家标准GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[2]，从标准实施之日起，质量检验机构和乳品企业开始采用此标准进行乳及乳制品中三聚氰胺的检测。
高效液相色谱法测定奶制品中的三聚氰胺
5μm)；流动相为乙腈 - 缓冲液(7.5:92.5)；流速 1.0ml/ min；柱温 2 0 ℃；进样量 20μl；流动相和试样液使用 前过 0.45μm 滤膜。
1.3.3 试样液提取、净化 称取 5g(称准至 0.1mg)样品于 50ml 具塞比色管中，
2.4 样品中三聚氰胺的提取与净化 三聚氰胺呈弱碱性，可溶于甲醇和乙腈，三氯乙
酸能使其转化成盐。用三氯乙酸 - 乙腈为提取剂，通过 超声和离心，制得的提取液较浑浊，因为样品基质复 杂。本研究用三聚氰胺含量较高的三鹿奶粉为提取样 品，以加 2ml 醋酸铅溶液作沉淀剂和不加醋酸铅溶液作 对比实验，发现加醋酸铅沉淀剂，所得提取液清亮， 但测定结果偏低 22.92%，说明加沉淀剂尽管能使提取液
9.96
0.034
三
0.032
聚
0.030
氰
0.028
胺
0.026
0.024
0.022
0.020
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 时间(min)
图 ４ 三聚氰胺标样色谱图(1μg/ml) Fig.4 HPLC chromatogram of melamine standard (1 μg/ml)
ion exchange column, followed by HPLC determination. Melamine was separated by a DBS-C8 column (4.6 × 150 mm, 5μm,
Thermo) using acetonitrile–cushion solution (1-pentan esulfonic acid sodium salt – citric acid monohydrate) as mobile phase
GBT22388奶粉中的三聚氰胺检测液相色谱质谱法课件
学习交流PPT
3
三聚氰胺检测原理（LC/MS/MS）
• 标准中：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳 离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/ 质谱检测和确证，外标法
• 本实验室用0.2 mol/L高氯酸溶液提取，增加了 “样品经0.2 mol/L高氯酸溶液提取后加入10 mL 二氯甲烷萃取”,离心，取上层过柱，内标法定 量，固相萃取净化步骤同标准。
• Nebulizer: 35psi。
学习交流PPT
9
注意事项
每批检测样做样顺序为试剂空白、样品空白、样品加标、样品。 加标回收：移取0.2 mL，0.1 μg/mL标准溶液至样品中，相当于0.01
mg/kg添加水平，加入0.2mL 0.2 μg/mL内标工作液，初测加标要选 同等基质的样品做空白，样品复测做平行样，复测时如没有同等基 质的空白样品则直接在样品中加标，加标量为初测时样品中的含量 3倍，且加入内标量也应与三聚氰胺含量相当，样品提取液在过固 相萃取柱之前稀释到合适的范围，取稀释液过固相萃取柱，且应保 证最终上机工作液中内标的含量为10.0ng/mL . 检测结果无需校正回收率，检测结果应减去试剂空白。 每次检测结果应与标准谱图对照，如相同浓度标液峰面积偏差较大， 应及时查找原因；
洗脱液于 50 ℃氮气吹干 2.0 mL 乙腈+水（9+1）洗脱、过滤，上机检测
学习交流PPT
7
标准曲线配制
曲线浓度
2、5 、10 、20ng/mL(各含内 标10.0 ng/mL)
曲线
工作液
移取体积 （mL）
0.2
0.5 0.1μg/mL
1.0
2.0
内标0.2ug/mL 0.5
稀释至 10 mL
高效液相色谱法分析(三聚氰胺)原始记录
f--稀释倍数
质控
（自控）
情况
质控措施
样品总数
平行样个数
质控样个数
仪器使用情况使用前：使用后：
检验人：复核人：审核人：
高效液相色谱法分析（三聚氰胺）原始记录（续页）第页，共页
样品编号
试样质量
(g)
定容体积
（mL）
峰面积（A）
浓度
（μg/mL）
结果
（mg/kg）
平均值
（mg/kg）
相对
偏差（%）
备注
试验允差要求：≤10%
高效液相色谱法分析（三聚氰胺）原始记录
受理号：第1页，共页
检测项目
三聚氰胺检测开始时间 Nhomakorabea年月日检测依据
GB/T 22388-2008第一法
检测结束时间
年月日
检测方法
高效液相色谱法
温度及相对湿度
℃％
仪器名称及型号
高效液相色谱仪
仪器编号
××/××-
FA2004电子天平
××/××-074
样品处理情况
按照GB/T 22388-2008/对样品进行处理。
Y=aX+b a= b= r=
检出限
/
定量限
2mg/kg
样品空白值
计算公式：X=
式中：
X--试样中待测组分残留量（mg/kg）；A--样液中待测组分的峰面积；
As--标液中待测组分的峰面积；C--标准溶液中待测组分的浓度，（μg/mL）；
m--称取的试样质量，（g）；V--试样最终定容体积，（mL）；
混合标准使用液名称及浓度
三聚氰胺标准溶液及其浓度：1mg/mL
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测标准问世
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测标准问世
佚名
【期刊名称】《食品指南》
【年(卷),期】2009(000)001
【摘要】由中国检验检疫科学研究院等起草单位制定的GB／T22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》近日正式发布．本标准包括三个方法：第一法高效液相色谱法，第二法液相色谱-质谱／质谱法，第三法气相色谱-质谱联用法。
本标准高效液相色谱法的定量限为2mg／kg，液相色谱-质谱／质谱法的定量限为0．01mg／kg．气相色谱-质谱法的定量限为0．05mg／kg。
【总页数】1页(P80)
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.1
【相关文献】
1.国家质检总局、国家标准委发布《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准 [J],
2.试论用高效液相色谱(HPLC)检测原料乳与乳制品中三聚氰胺的原理和方法 [J], 崔立华
3.三聚氰胺检测七显微镜检测乳与乳制品中的三聚氰胺 [J], 郦韬珉;颜敏茹;徐亚麦
4.国家质检总局、国家标准委发布《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准 [J], 无
5.中华人民共和国国家标准原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 [J],
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高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中三聚氰胺检出限的确定
２ ０ ０ ８年 三鹿奶 粉 三 聚氰胺 事 件 发 生后 ， 三 聚氰 胺 问题 引起 了各 方关 注 ，给人 民生 活带 来 了巨 大影 响 。卫生 部 于
涡 旋混 合 器 ， 高速 离 心机 ； 三 聚氰 胺 标样 （ 中国标 准 物 质 中 心） ， 乙腈 （ 色谱 纯 ） ， 甲醇 （ 色谱 纯 ） ， 辛烷磺酸钠（ 色谱 级 ） ， 三氯 乙酸 （ 化学 纯 ） ， 市售 某 品牌 婴 幼儿 奶粉 。
Ｇ Ｂ ／ Ｔ ２ ２ ３ ８ ８ — ２ ０ ０ ８原 料乳 与乳 制 品 中三 聚氰 胺 检测 方 法 中 ，
流速 ： １ ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ ， 柱温 ： ４ ０℃ ， 进样量 ： １ ０ Ｌ ， 洗 脱 条 件 ： 乙腈 ： 离子 对缓 冲液 为 １ ２： ８ ８ 。
１ ． ３ 标 准溶 液配 制 用流 动相 将 三聚氰 胺标 准储 备液 逐级 稀 释得 到浓 度 为 ０ ． ８ 、 ２ ． ０ 、 ２ ０ ． ０ 、 ４ ０ ． ０ 、 ８ ０ ． ０ ｇ ／ ｍＬ的标 准 工 作 液 ， 浓度 由低 到
宁 夏农林科技， Ｎ ｉ ｎ ｇ ｘ ｉ ａ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ． ａ ｎ ｄ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ． Ｓ ｃ ｉ ． ＆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ． ２ ０ １ ３ ， ５ ４ （ ！ ！ 二 鱼
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高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中三聚氰胺检出限的确定
Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｏ ｆ ｍｅ ｌ ａ ｍｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ ｆ ａ ｎ ｔ ｍｉ ｌ ｋ ｐ ｏ ｗ ｄ ｅ ｒ ｂ ｙ ＨＰ Ｌ Ｃ ｗａ ｓ ｃ ａ ｌ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｆ ｏ １ ２ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ． ｒ ｈ ｅ
奶粉中三聚氰胺残留的检测
奶粉中三聚氰胺残留的检测摘要本试验采用C18柱作为色谱分析柱，90％离子对试剂为流动相，奶粉样品经混合均匀后，用三氯乙酸一乙腈溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化、富集后，在紫外检测器240nm处用高效液相色谱仪测定，保留时间在19.92～19.96min。
标准曲线在 1.0～80.0μg/ml浓度内呈线性相关，相关系数（r）为1.00000。
在空白奶粉样品中添加10 mg/kg的三聚氰胺，回收率为97.69％，相对标准偏差（RSD）为3.02％。
关键词奶粉；三聚氰胺；检测三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、蛋白精、氰尿酰胺、三聚酰胺。
分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m3；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性；化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
三聚氰胺没有任何营养价值，是国家禁止在食品或饲料中使用的添加物，但因其含氮量高被一些造假者利用，添加在饲料或食品中，造成蛋白质含量较高的假象，以获得更高利润，却造成了诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉及鸡蛋中检出三聚氰胺等严重食物安全事故，造成严重的社会影响。
研究表明三聚氰胺能导致小鼠膀胱肿瘤，是一种潜在的致癌物质，在水中分解成氰尿酸，动物身体无法转化这种物质，在肾脏通过其分子结构上的氢氧基与氨基之间形成不溶于水的大分子氰尿酸三聚氰胺，大量氰尿酸三聚氰胺聚集于肾脏形成结石，造成肾小管的阻塞，导致尿液无法顺利排除，使肾脏积水，最终导致肾脏衰竭，严重将导致死亡。
高效液相色谱法测定乳粉中三聚氰胺的方法优化
高效腋相色谱法测定乳粉中三聚氟服的方法优化■文丨卢竹阳沈蕾陈丹莹柏宁江苏省南通市产品质量监督检验所二聚気胺含氮量高，俗称“伪蛋白”，几乎无味，微二^溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甲醛等，经常被用作化工原料，对健康有害，我国明确规定三聚氟胺不是食品原料，也不是食品添加剂，禁止人为添加。
“三鹿奶粉”事件影响恶劣，也给食品检验机构敲响警钟，三聚氧胺参数在乳品检测中成了必检指标，研究其检测方法尤为重要。
GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氧胺检测方法》明确规定，测定三聚気胺有三种方法，即液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法前两种方法涉及的仪器高端精密，费用昂贵，后续维护保养较为繁琐，不具备普遍性，本文对高效液相色谱法检测乳粉中三聚氧胺的前处理和色谱条件进行了优化。
一、材料和方法1.仪器。
Agilent-1200高效液相色谱仪（VWD）,多功能氮吹仪，高速冷冻离心机，数控超声波清洗器，电子天平（I级），固相萃取联用仪，SPE小柱：Poly-Sery MCX,60mg/3mL o2.试剂。
三聚氟胺标样（1.0mg/mL）,甲醇、乙睛、正己烷均为色谱纯，柠檬酸、辛烷磺酸钠、氨水、三氯乙酸均为分析纯。
3.样品前处理。
（1）提取"准确称取lg乳粉置于50ml具塞离心管中，加入8ml三氯乙酸溶液（1%）和2ml乙睛,超声提取约lOmin,涡旋提取约lOmin,9500r/min离心8min,取上清液于50ml离心管中；残渣重复提取一次，合并两次提取液，加入10ml三氯乙酸溶液和饱和的正己烷溶液，涡旋振荡lmin,9500r/min离心6min,取下层清液，待净化.（2）净化"依次用3ml甲醇和5m冰对SPE小柱进行活化和平衡，抽至近干；将待净化的清液转至SPE小柱中，用3ml水和3ml甲醇进行淋洗，抽至近干；用6mL氨化甲醇溶液（5%）洗脱，洗脱液于5（TC氮气吹干，残留物用lml 流动相定容，涡旋混合lmin,过0.22|xm微孔水相滤膜后，供测定。
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法（1）执行标准：《GB/T22388-2008原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法》（2）方法及谱图1液相色谱检测方法样品前处理：称取2g试样于50ml具塞离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液、5ml乙腈溶液和5%醋酸铅溶液（质量比）2ml，超声提取10min，再震荡提取10min后，以5000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容到25ml，移取5ml滤液，加入5ml水混合均匀后，全部上样。
净化处理：活化：5ml甲醇、5ml水依次活化固相萃取小柱上样：将全部待净化液以1ml/min的流速通过固相萃取小柱淋洗：依次用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取小柱，淋洗完毕后，抽至近干洗脱：用6ml5%氨化甲醇(v/v)(5%氨化甲醇：5mL氨水+95mL甲醇)溶液以1ml/min，洗脱液于50℃下氮气吹干，残渣用1ml流动相定容，涡旋混合1min，0.45μm过滤。
色谱条件：色谱柱：Venusil TM XBP C8(L)4.6×250mm，5μm流动相：缓冲盐溶液-乙腈=85:15缓冲盐配制：准确称柠檬酸2.10g和辛烷磺酸钠2.16g，加入约980ml水溶解，调节pH到3.0后，定容至1L紫外检测器波长：240nm；流速：1ml/min；进样量：20μL三聚氰胺标准品牛奶中的三聚氰胺2液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）样品前处理：称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入8ml三氯乙酸溶液、2ml乙腈溶液和5%醋酸铅溶液（质量比）2ml，超声提取10min，再震荡提取10min后，以5000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
净化处理：活化：5ml甲醇、5ml水依次活化固相萃取小柱上样：将全部待净化液以1ml/min的流速通过固相萃取小柱淋洗：依次用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取小柱，淋洗完毕后，抽至近干洗脱：用6ml5%氨化甲醇(v/v)(5%氨化甲醇：5mL氨水+95mL甲醇)溶液以1ml/min，洗脱液于50℃下氮气吹干，残渣用1ml流动相定容，涡旋混合1min，0.45μm过滤。
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法
ICS 67.100C 53中华人民共和国国家标准GB/T 22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法Determination of melamine in raw milk and dairy products2008-10-07 发布2008-10-07 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布前言本标准包括三个方法：第一法高效液相色谱法，第二法液相色谱-质谱/质谱法，第三法气相色谱-质谱联用法，检测时，应根据检测对象及其限量的规定，选用与其相适应的检测方法。
本标准的附录A 为资料性附录。
本标准由全国食品安全应急标准化工作组、全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会提出并归口。
本标准第一法起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、北京市疾病预防控制中心、国家乳制品质量监督检验中心、浙江省质量技术监督检测研究院、国家加工食品质量监督检验中心（广州）。
本标准第一法主要起草人：宋书锋、鲁杰、安娟、杨大进、李淑娟、张晶、刘艳琴、杨红梅、杨金宝、鄂来明、廖上富、陈小珍、蔡依军、郭新东、吴玉銮。
本标准第二法起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、中国疾病预防控制中心、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。
本标准第二法主要起草人：彭涛、吴永宁、邵兵、王浩、李晓娟、郭启雷、苗虹、赵云峰、丁涛、李立、蒋原。
本标准第三法起草单位：上海市质量监督检验技术研究院、国家食品质量安全监督检验中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准第三法主要起草人：巢强国、常宇文、雷涛、陈冬东、赵玉琪、周耀斌、穆同娜、葛宇、曹程明、张辉、麦成华、曹红。
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法1 范围本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS）]。
如何在乳制品三聚氰胺检测时进行前处理优化
最近，小编在用不同的奶粉基质按照国标方法《GBT22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法第二法液相色谱-质谱/质谱法》做三聚氰胺实验时，发现回收率不好且过SPE小柱之前的待上样液较浑浊，因此小编依据国标方法对实验过程进行了一些优化。
首先，按照国标方法小编进行了一次实验，实验方法如下图所示。
在实验过程中，小编发现过滤之前的提取液悬浮物较多，且有明显的脂肪漂浮在上层，因此可以判断实验所用奶粉基质脂肪含量较高。
在过滤之后，提取液依然较浑浊，在SPE上样过程中，小柱有堵塞现象且有泡沫从小柱中流出，小编判断应该是蛋白质没有沉淀完全。
最后，小编做出来的回收率较差。
按照第一次实验的结果，小编进行了一些优化，为了提取更充分，将震荡提取10min改为涡旋提取10min，为了让蛋白质沉淀更充分，在离心之前，将样品放在-20℃沉淀30min，并且将离心的条件改为在4℃条件下，10000r/min离心10min。
因为此次基质奶粉的脂肪含量较高，因此离心之后小编取上清液，按照国标备注要求加入10ml三氯乙酸溶液饱和的正己烷。
参考国标备注要求如下图所示：上清液涡旋1min，并在4℃条件下，10000r/min离心5min，取下清液，发现溶液较澄清，另外为了减少目标物的损失，同时，小编省去了过滤的步骤，SPE过程非常顺利且没有再出现小柱堵塞的情况。
最后三聚氰胺的回收率在80%左右，依然不是非常理想，需要再次优化。
根据第二次实验结果，小编怀疑奶粉基质中可能有部分目标物没有提取出来或者在上样、淋洗过程中有损失，因此小编进行了二次提取，并进行了分布收集，二次洗脱，最后小编发现上样、淋洗以及二次洗脱中都没有目标物，奶粉的回收率已经达到了95%-105%，满足了此基质下检测的要求。
最终优化后的实验步骤和谱图如下：1、提取称取1g（精确至0.01g）试样于50ml具塞塑料离心管中，加标（10ppm，100ul；10ppm，200ul），加入8ml三氯乙酸溶液和2ml乙腈，超声提取10min，涡旋提取10min，10000r/min 离心10min，取上清液于另一50ml离心管，残渣重复上述步骤再提取一次，合并两次提取液，加入10ml三氯乙酸溶液饱和的正己烷溶液，涡旋1min，10000r/min离心5min，取下层清液，待净化。
液态奶和奶粉中三聚氰胺的测定
液态奶和奶粉中三聚氰胺的测定依据 GB /T 22388-20081. 前处理预处理：液态奶：取原料乳5g，于50ml 离心管中，分别加入500ul，10ppm 的标准液（保证每kg 原料乳中各含1mg 标样）、15ml 0.1%三氯乙酸溶液和5ml 乙腈，涡旋1min，超声20min，4500r/min 离心15min。
取出上清液，用0.1%三氯乙酸定容至25ml 容量瓶中。
振荡均匀，从中取5ml，再加入5ml 水作为上样液。
奶粉：取奶粉5g，于50ml 离心管中，分别加入500ul，10ppm 的标准液（保证每kg 奶粉中各含1mg 标样），15ml 0.1%三氯乙酸溶液和5ml 乙腈，涡旋1min，超声1h，放置冰箱中2h，4500r/min 离心15min。
取出上清液，用0.1%三氯乙酸定容至25ml 容量瓶中。
振荡均匀，从中取5ml，再加入5ml 水作为上样液。
Ps：由于奶粉不含水份，相对与液态奶，脂类与其他添加成分可能更多，因此增加超声时间及冷却步骤，以保证蛋白沉降完全。
净化：固相萃取小柱：InertSep MPC 3ml/60mg 货号5010-27121 或WondaSep MPC 3ml/60mg 货号5010-MPC活化：3ml 甲醇和5ml 水上样：前处理后，备用的上样液淋洗：3ml 水、3ml 甲醇洗脱：6ml 5%氨水-甲醇浓缩复溶：40 度氮气吹干，加入1ml 3Mmol/L 醋酸铵溶液：乙腈=20：80 的流动相，滤膜过滤后，HPLC 分析。
2. 色谱分析色谱柱：Inertsil HILIC 5um 4.6*250mm流动相：A—2 mmol/L 醋酸铵溶液 B—乙腈梯度表如下：表1 梯度表时间2Mmol/L 醋酸铵溶液乙腈（%）0 20 8010 20 8010.01 50 50。
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2016.02.29
1 性质
三聚氰胺：别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。 分 子 式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 ；分 子 量： 126.12 物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味； 相对密度：1570kg/m³； 熔点：在常压下，354℃分解； 升华温度：300℃； 溶 解 性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、 甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、 苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性
三聚氰胺检测原理（LC/MS/MS）
标准中：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取， 经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相 色谱-质谱/质谱检测和确证，外标法 本实验室用0.2 mol/L高氯酸溶液提取，增 加了“样品经0.2 mol/L高氯酸溶液提取后 加入10 mL二氯甲烷萃取”,离心，取上层 过柱，内标法定量，固相萃取净化步骤同 标准。
化学性能
三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料， 显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐； 在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基 逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚 氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应 生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树 脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防 火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地 板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水 和阻燃剂
Time(min ) A% 0.0 95 1.0 95 2.0 50 4.5 50 4.6 95 8.0 95
注意事项
每批检测样做样顺序为试剂空白、样品空白、样品加标、样品。 加标回收：移取0.2 mL，0.1 μg/mL标准溶液至样品中，相当于0.01 mg/kg添加水平，加入0.2mL 0.2 μg/mL内标工作液，初测加标要选 同等基质的样品做空白，样品复测做平行样，复测时如没有同等基 质的空白样品则直接在样品中加标，加标量为初测时样品中的含量 3 倍，且加入内标量也应与三聚氰胺含量相当，样品提取液在过固 相萃取柱之前稀释到合适的范围，取稀释液过固相萃取柱，且应保 证最终上机工作液中内标的含量为10.0ng/mL . 检测结果无需校正回收率，检测结果应减去试剂空白。 每次检测结果应与标准谱图对照，如相同浓度标液峰面积偏差较大， 应及时查找原因；
标准曲线配制
2、5 、10 、20ng/mL(各含内 曲线浓度 标10.0 ng/mL)
工作液
移取体积 （mL） 0.2 曲线 0.5 0.1μg/mL 1.0 稀释至 10 mL 浓度 （ng/mL） 2 5 10
2.0
内标0.2ug/mL 0.5
20
10
3．色谱条件
• 仪器型号：Agilent 1200-6410 LC/MS (08JL016) • 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC 1.7 μm • 流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL； • 流动相：A醋酸铵水B乙腈；梯度洗脱； • Iron Source：ESI+；Capillary：4kV； • Fragmentor：105；delta EMV：300； • Gas Temp：110 ℃； Gas Flow：11L/hr； • Nebulizer: 35psi。
流程图
称样 2g 50 mL 离心管 均质 振荡萃取，4000 r/min 离心 5 min 0.2 mol/L 高氯酸溶液 9.8 mL 0.2 μg/mL 内标溶液 0.2 mL 10 mL 二氯甲烷
取水相（上层）5 mL 过柱（用前预活 化） 3mL 水和 3mL 甲醇洗涤柱子，弃去洗液 3mL5%的氨化甲醇洗脱柱子，收集洗脱液 洗脱液于 50 ℃氮气吹干 2.0 mL 乙腈+水（9+1）洗脱、过滤，上机检测
检出限
HPLC/MS/MS：0.01 mg/kg HPLC:2mg/kg, 准确加入0.2 mol/L高氯酸溶液9.8 mL、 0.2 μg/mL三聚氰胺内标溶液0.2 mL，均质，加入 10 mL二氯甲烷，振荡，4000r/min 离心5分钟，准 确移取5 mL上清液过混合性阳离子交换固相萃取 柱（用前用3 mL甲醇、3 mL水活化），分别用 3mL水和3mL甲醇淋洗柱子，再用3.0 mL 5%氨水 甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准 确加入乙腈+水（9+1）2.0 mL，涡旋振荡，洗脱 液用0.25 μm微孔滤膜过滤，上机测定。