GBT22388奶粉中的三聚氰胺检测液相色谱质谱法课件
三聚氰胺 - 副本
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液相色谱-质谱/质谱法
原理：
试样用三氯乙酸溶液提取， 提取液离心后经阳离子交换 固相萃取柱净化后，用液相 色谱-质谱/质谱法测定和确证， 外标法定量。
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用HPLC分析酸碱性物质， 试剂与材料 由于吸附作用（次级保留） 使色谱峰拖尾。加入改良 • 乙酸 剂可以大大改善峰形，提 • 乙酸铵。 高积分准确度，这里乙酸 • 乙酸铵溶液（10铵的作用也就是改良剂的 mmol/L）： 作用，可以减少次级保留， 准确称取0.772 g 乙酸铵于1 改善峰形。
阳离子交 换固相萃 取柱、定 型滤纸
离子对缓冲 溶液、三聚 氰胺标准品、
化学纯、色谱纯、分析纯的区别：
• 化学纯、分析纯、色谱纯,是指试剂的纯 度级别,化学纯是指一般化学试验用的， 有较少的杂质，不妨碍实验要求。分析 纯是指做分析测定用的试剂，杂质更少 ，不妨碍分析测定。色谱纯是指进行色 谱分析时使用的标准试剂，在色谱条件 下只出现指定化合物的峰，不出现杂质 峰。
超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于 4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润 湿的滤纸过滤后，做待净化液。
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净化：
将待净化液转 移至固相萃取 柱中。
整个固相萃取过程流 速不超过1 ml/min。洗
脱液于50℃下用氮气
吹干，
1 2
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定性判定
1. 按照上述条件测定试样 和标准工作溶液，如果 试样中的质量色谱峰保 留时间与标准工作溶液 一致（变化范围在 ±2.5%之内）；
2.样品中目标化合物的 两个子离子的相对丰度 与浓度相当标准溶液的 相对丰度一致，相对丰 度偏差不超过表3的规 定，则可判断样品中存 在三聚氰胺。
三聚氰胺的检测液相法课件
检测_样品预处理
如需净化，按以下步骤操作: ☻小柱活化：依次用3mL甲醇和3mL
水活化小柱。 ☻上样：准确吸取10mL（可根据实
验情况调整）滤液转移至固相萃取 柱中。
22
检测_样品预处理
☻净化：再用3mL水和3mL甲醇分别 洗涤，抽至近干。
☻洗脱：用6mL氨化甲醇溶液洗脱 ，收集全部洗脱液。
☻控制流速在1mL/min以内。
4 1200
3 1000
安赛蜜
2 800
1 600
0 400
-1 200
-2
00
5
10
15
20
25
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
30
min
4
4.5 min
27
检测_调节流动相
☻水相︰乙腈=90︰10 适宜大多数的样品。
☻适当增加水相的比例可推迟出峰 时间，使分离度变大。
28
☻计算 ☻检出限
结果
10
10.224
5
0
-5
-10
0
5
10
15
20
25
30
min
18
检测_标准品曲线
C om pound #1, VW D 1 A A re a = 3 4 .9 4 7 2 7 3 3 *A m t + 0 .5 8 4 0 4 8 3
A re a R e l. R e s % (1 ): -3 .1 2 1 4 e -1
6
三聚氰胺
☻遇强酸或强碱水溶液水解，胺基 逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸 二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸 一酰胺，最后生成三聚氰酸。
三聚氰胺含量测量不确定度分析 GBT 22388-2008
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
100ml容量瓶
0.10
0.058%
3.2标准系列浓度-峰面积拟合直线求得C产生的相对标准不确定度
标准系列浓度—峰面积拟合直线求得u’2(C)=u2(C)/C，每个浓度分别进样2次，根据公式Aj=CjB1+B0线性最小二乘法拟合，求得B0、B1，结果见表2。
表2三聚氰胺标准系列峰面积测定结果及拟合方程
项目
浓度C
（mg/l）
峰面积A
1
2
平均值
三聚
氰胺
0.0
0
0
0
2.0
173604
174048
173826
4.0
346195
345521
345858
8.0
662178
661356
661767
16.0
1326655
1327584
1327120
20.0
1674771
标准溶液配制及稀释过程引起的相对合成标准不确定度
= %
=0.661%
表1量器容量允差表
规格（ml）
容量允差值（A级±ml）
相对标准不确定度
2Байду номын сангаасl单标吸管
0.010
0.289%
10ml刻度吸管
0.05
0.289%
10ml刻度吸管
0.05
0.289%
25ml刻度吸管
0.10
三聚氰胺的检测方法ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
4. 洗板：孔内液体甩干，每孔加洗涤液250µl，洗涤4-5次， 最后用吸水纸拍干；
5. 显色：加显色液A、B各50µl，混匀，盖板避光反应10min; 6. 测定：加终止液50µl，混匀，在酶标仪450nm读OD值。 7. 结果判定：标准品、样品输入软件计算
一、概要
• 三聚氰胺（Melamine）简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合 物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水、对 身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。长期或反复大量摄入对 肾与膀胱产生影响，导致产生结石。
• 检测方法：①气相色谱质谱法（GC-MS） ②液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS） ③高效液相色谱法(HPLC) 准确；成本高、操作复杂 ④ELISA——试剂盒检测 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
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四、注意事项
1. 试剂盒选用不同，操作过程不同，请按购买试剂盒 说明操作；
2. 室温低于20℃或试剂及样本未回到室温20-25℃， 会导致OD偏低；
3. 每加一种试剂前要将其摇匀； 4. 不同批号试剂盒不要混用；
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高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。
三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。
本文参考了以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。
1 实验部分1.1 仪器与试剂LC1600高效液相色谱仪（含UV1600紫外-可见检测器1台，P1600高压恒流泵1台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。
1.2 标准品溶液配制精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
1.3 样品前处理称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。
取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC 测定溶液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm)流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min波长：240nm温度：40℃进样量：20μl2 实验结果2.1 精密度实验取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.57％。
食品中三聚氰胺的检测方法PPT课件
红外光谱检测
原理： 在红外线照射下每种分子都有其结构和组
成决定的独有的红外吸收光谱 对纯奶粉与加入少量三聚氰胺的奶粉样品
绘制红外透过率光谱图，通过比较，定性 判断聚氰胺特定官能团及特征峰
红外光谱检测
仪器设备： ①日本岛津 傅里叶变换红外光谱仪
IRPrestige-21型 ②天津市科器高新技术公司 压片机 ③电子天平 ④玛瑙研钵 样品准备： 全脂奶粉 三聚氰胺 溴化钾
超高效液相色谱—质谱联用 法
利用超高效液相色谱电喷雾串联三 重四级杆质谱技术可测定食品中的三 聚氰胺， 利用三氯乙酸溶液提取蛋白 中的三聚氰胺并形成蛋白络合物沉淀，
液相色谱—质谱联用仪 乙酸铅溶液结合含有 SO42-、SO32-等
离子的杂质形成沉淀，进一步提高了 提取效率，三氯乙酸可作为离子对试 剂进行液相色谱—质谱分析。
应生成三聚氰胺盐 在强碱或强酸液中能发生水解 氨基逐步被
羟基取代 生成三聚氰酸 三聚氰酸一酰胺 和三聚氰酸二酰胺
三、毒奶粉事件
1、为什么奶粉中加入三聚氰胺？
蛋白质的含量是奶粉质量的主要标志之一 奶粉中加入三聚氰胺时候显示其氮含量很高 1公斤稀释奶中自然溶入的3.3克三聚氰胺
核磁共振仪
电位滴定法
电位滴定仪 胺消聚于属定不的耗氰化常溶大以溶硫胺工量液于硫液酸含产检中0酸.，标量品测三5%标准的中。聚然准溶方三利氰后溶液法聚用胺根液的。氰电的据滴体胺位含等该定积的滴量当方含计检定，量法三算测法R点多聚S三，测时用D氰 测柱3①也美2①常婴每红3纯营3若3采5若四光①5以光2蛋测柱婴3采营测柱③四3营光2②0494490、、 、 、 、 、定，日就国将温幼个外奶养样用样、程将上程白定，幼用养定，三、养程天266216人 人毛毛长人74774m原 以 本 是 食 纯 下 儿 样 光 粉 不 品 固 品 三 差 纯 内 差 质 原 以 儿 固 不 原 以 聚 三 不 差 津cccccg体 体细细期体mmmmm料乙岛说品度在的品谱a良在相在聚度容的料乙的相良料乙氰聚良市和===能 能管管摄能--11乳腈津一及为水营扫图，傅萃傅氰为全含乳腈营萃，乳腈胺氰，科1333三111承 承电电入承5444///444和和个药9中养描认身里取里胺9面量和和养取身和和1胺身器聚011122傅m受 9受泳9泳三受m99988乳柠品的主识体叶液叶的分是乳柠主液体乳柠的体高63氰％％里ccc55gg三 三法法聚三02mmm22与制檬监溶要：小红质红检析奶制檬要质小制檬检小新胺溴公溴次溴叶cc聚 聚氰聚1品酸督解摄纵，外分外测了粉品酸摄分，品酸测，技mmb等等化斤化化变5氰 氰胺氰求--中管度入坐脑光析光方目质中入析脑中方脑术———NNN0等 等钾的钾钾11含换胺胺 的 胺m平和 和HHH三理为是标袋谱三谱法前量三是三袋三法袋公辛辛辛进11成有红g222最 最危最均5511聚局奶为大图聚图三的聚奶聚大聚大司烷烷烷溴反反反行年000737外大 大害大值mm.44.氰的粉透中氰中聚主氰粉氰氰磺磺磺化对对对混人压光55量 量量ggcc胺标过胺氰要胺胺胺酸33酸酸钾称称称合每通通片谱mm蛋44蛋采准率污胺标采污采钠钠钠进伸伸伸研66日过过--机仪白白1177用：，染的志用染用缓缓缓行缩缩缩磨可玛玛mmIR质质为为三横的检之的H冲H冲H冲混振振振--，容瑙瑙P11奶奶PPPr聚坐配测一配液液液合动动动压忍糖糖研研33eLLL粉粉44sCCC氰标方方方为为为研制摄类类体体11ti甲甲g99胺为奶法奶流流流磨透入进进ecc基基脂脂以 以 以mm-每波粉，粉动 动 动压明量行行2肪肪三--三三1日长和为和相相相制薄11为研研氨氨型、、氯氯氯可蛋三蛋λ成片3磨磨基基117乙（乙乙容糕聚糕三。。55.酸酸55酸酸酸忍时氰时聚μ的的11m乙乙乙cc摄，胺，氰特特mm）腈腈腈入的胺--征征所所11或为为为量检透和和吸吸得得波提提提为测明88收收结结11数取取取研0薄44峰峰果果.cc（液液液究片mm与与c，，，提。--m11NN经经经处处供-MM1混混混有有）了RR合合合明明例参分分型型型显显1考析析：阳阳阳特特。相相O离离离征征同同c子子子t吸吸a。。n交交交收收e（换换换峰峰辛固固固烷相相相）萃萃萃红取取取外柱柱柱光富富富谱集集集图净净净化化化后后后采采采用用用
奶粉中三聚氰胺的测定
奶粉中三聚氰胺的测定Determination of melamine in milk powder1 原理三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。
本方法采用20%甲醇溶解样品，5%三氯乙酸沉淀蛋白，提取样品中的三聚氰胺，经液相色谱仪C18柱分离，检测波长235nm条件下进行检测。
2 试剂使用优级纯、色谱纯试剂，色谱用水符合GB/T6682一级水的规定。
2.1 20%甲醇溶液：甲醇+水(2+8)2.2 5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5g溶解于100mL水中。
2.3 乙腈2.4 混合液：称取2.10g一水合柠檬酸和1.88 g己烷磺酸钠，溶于水中，稀释至1000mL 混匀。
2.5 流动相：混合液（2.4）+乙腈（2.3）=92+8。
2.6 标准储备液配制：准确称取三聚氰胺标准品0.1000g，用20%甲醇溶液（2.1）定容至100mL。
三聚氰胺含量为1.00mg/ mL，于4℃冰箱内避光保存。
2.7三聚氰胺标准系列的配制：准确吸取标准储备液(2.6)0.100mL；1.00mL；2.50mL；5.00mL；10.00mL至100mL容量瓶中，并用20%甲醇溶液（2.1）定容至刻度。
配制成三聚氰胺浓度分别为1.00mg/L；10.0mg/L；25.0mg/L；50.0mg/L；100mg/L的标准系列。
3仪器和设备3.1 液相色谱仪：附二级管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV）3.2 超声波清洗器3.3 超速离心机3.4 涡旋混合器3.5 滤膜：0.45μm4 分析步骤4.1 试样处理：将奶粉样品混匀，准确称取样品1～5g于50mL比色管中，加入20%甲醇溶液（2.1）约35mL ，震荡混匀，超声提取5min ，加入5%三氯乙酸(2.2)5mL ，并用20%甲醇溶液(2.1)定容至刻度，摇匀。
以3000rpm/min 超速离心5min 。
高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的分析
2009.6D a i r y I n d u s t r y □ 乳品加工奶酪中的钙、磷的营养亲密度分别为1.3~7.0以及2.6~5.7（表5）。
从表5中可以发现，同一种类的奶酪，其脂肪含量越高，钙、磷的含量越低；而使用凝乳酶生产的奶酪中，钙含量通常要高于用酸法生产的干酪。
干酪中的钙、磷以及其它矿物质元素可被人体利用，这一点和乳中的这些矿物质元素没有区别。
奶酪的生生素也都进入了凝乳，相反，大部分水溶性维生素都在凝乳过程中随着乳清析出而排出（表6）。
2 结论奶酪营养成分丰富，主要为蛋白质和脂肪，其脂肪和蛋白质含量较原料奶中的蛋白质和脂肪提高了10倍。
此外，所含的钙、磷等无机成分，除参考文献[1]Walstra P . Dairy Technology.New York ：Marcel Dekker Inc,1999[2]张和平，张列兵. 现代乳品工业手册（第一版）. 北京：中国轻工业出版社，2005[3]郭本恒.奶酪. 北京：化学工业出版社，2003[4]董幕莹，任发政.世界干酪文化鉴赏. 北京：化学工业出版社，2004[5]郭本恒.现代乳品加工学. 北京：中国轻工业出版社，2001[6]赵新淮，于国萍，张永忠，李铁晶. 乳品化学. 北京：科学出版社，2007■ 孙宇霞 呼伦贝尔市产品质量计量检测所【摘要】本文采用国家标准法中高效液相色谱法检测了乳及乳制中的三聚氰胺，经过反复使用和多次试验，从样品处理、净化、仪器测定3个方面，对国家标准中要求不详之处，进行了补充和改进。
对用液相色谱法检测三聚氰胺所用色谱柱和流动相进行了优选，将乳及乳制品中与三聚氰胺出峰时间重叠的组分进行了完全分离。
关键词：高效液相色谱法；三聚氰胺；检测分析高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的分析在“三鹿牌婴幼儿奶粉事件”发生后，国家标准化管理委员会紧急启动了标准制定程序，开展了原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法研究[1]，在第一时间制定并颁布了国家标准GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[2]，从标准实施之日起，质量检验机构和乳品企业开始采用此标准进行乳及乳制品中三聚氰胺的检测。
三聚氰胺培训ppt课件
精选版课件ppt
3
三鹿为什么使用三聚 氰胺？
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4
三聚氰胺的结构
化学名：三聚氰胺 分子式：C3H6N6 分子量：126.15 俗称：密胺、蛋白精
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5
• 在食品制作需要检查蛋白质含量，但是直 接检测蛋白质含量技术比较复杂，所以业 内常常使用“凯氏定氮法” ，通过食品中 氮原子的含量来间接推算出蛋白质含量。
.酸性条件下，三聚氰胺因其 化学结构中特殊的3个伯氨 基团而较易质子化形成正离 子，即弱阳离子化合物。
化学性质
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10
三氯乙酸的作用
• 1.具有沉淀蛋白质的作用，常用作蛋白基质 样品中三聚氰胺的提取。
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11
固相萃取柱
• 固相萃取柱（SPE）基于液-固相色谱理论，采用 选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、 分离、净化。SPE是利用选择性吸附与选择性洗 脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液 体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再 选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅 速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩 的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物 质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合 适的溶剂选择性洗脱被测物质。
• 也就是说，食品中氮原子的含量越高，蛋 白质含量也就越高。因此三聚氰胺被派上 大用场。
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6
三聚氰胺检测方法
参照GB/T 22388 –2008
方法一高效液相色谱法(HPLC)
1、实验原理
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7
样品前处理
• 1、提取
精选版课件ppt
8
2、净化
精选版课件ppt
乳制品中三聚氰胺的含量的测定(高效液相色谱法)实验报告
2009级化学教育仪器化学综合性与设计性实验指导老师：曹** 2011年 5月 30号一、实验目的1．通过分析化学综合性实验、设计性实验，培养学生初步的解决分析化学实际问题的能力，培养学生的创新意识与创新能力。
2．学习查阅参考文献、综合参考资料、设计小型分析化学实验。
3．复习和巩固有关理论基础知识并用于指导实践。
4．进一步熟练掌握实验操作技术。
①实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）②摘要、关键词：[摘要]为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取, 离子交换萃取小柱净化, 结合高效液相色谱进行样品测定。
色谱条件: A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。
色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm），检测波长：239 nm结果表明: 三聚氰胺标准曲线为y = 4495951x +18978.83, 相关系数R = 0.9999693, 在0.17～110.0 mg/L范围内线性关系良好, 方法检出限为0.12 mg/L, 两个样品三个水平的加标回收率分别为96.34 % (RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21) 、104.29 % (RSD = 7.63) 和95.31 %(RSD = 4.39) 、89.25 % (RSD = 3.88) 、92.59 % (RSD = 5.27)。
[关键词]高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品③引言一、目前有关三聚氰胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine) ）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 通常用于塑料制品中合成树脂的生产[ 1 ] 。
GBT22388奶粉中的三聚氰胺检测液相色谱质谱法课件
学习交流PPT
3
三聚氰胺检测原理（LC/MS/MS）
• 标准中：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳 离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/ 质谱检测和确证，外标法
• 本实验室用0.2 mol/L高氯酸溶液提取，增加了 “样品经0.2 mol/L高氯酸溶液提取后加入10 mL 二氯甲烷萃取”,离心，取上层过柱，内标法定 量，固相萃取净化步骤同标准。
• Nebulizer: 35psi。
学习交流PPT
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注意事项
每批检测样做样顺序为试剂空白、样品空白、样品加标、样品。 加标回收：移取0.2 mL，0.1 μg/mL标准溶液至样品中，相当于0.01
mg/kg添加水平，加入0.2mL 0.2 μg/mL内标工作液，初测加标要选 同等基质的样品做空白，样品复测做平行样，复测时如没有同等基 质的空白样品则直接在样品中加标，加标量为初测时样品中的含量 3倍，且加入内标量也应与三聚氰胺含量相当，样品提取液在过固 相萃取柱之前稀释到合适的范围，取稀释液过固相萃取柱，且应保 证最终上机工作液中内标的含量为10.0ng/mL . 检测结果无需校正回收率，检测结果应减去试剂空白。 每次检测结果应与标准谱图对照，如相同浓度标液峰面积偏差较大， 应及时查找原因；
洗脱液于 50 ℃氮气吹干 2.0 mL 乙腈+水（9+1）洗脱、过滤，上机检测
学习交流PPT
7
标准曲线配制
曲线浓度
2、5 、10 、20ng/mL(各含内 标10.0 ng/mL)
曲线
工作液
移取体积 （mL）
0.2
0.5 0.1μg/mL
1.0
2.0
内标0.2ug/mL 0.5
稀释至 10 mL
奶粉中三聚氰胺残留的检测
奶粉中三聚氰胺残留的检测摘要本试验采用C18柱作为色谱分析柱，90％离子对试剂为流动相，奶粉样品经混合均匀后，用三氯乙酸一乙腈溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化、富集后，在紫外检测器240nm处用高效液相色谱仪测定，保留时间在19.92～19.96min。
标准曲线在 1.0～80.0μg/ml浓度内呈线性相关，相关系数（r）为1.00000。
在空白奶粉样品中添加10 mg/kg的三聚氰胺，回收率为97.69％，相对标准偏差（RSD）为3.02％。
关键词奶粉；三聚氰胺；检测三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、蛋白精、氰尿酰胺、三聚酰胺。
分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m3；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性；化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
三聚氰胺没有任何营养价值，是国家禁止在食品或饲料中使用的添加物，但因其含氮量高被一些造假者利用，添加在饲料或食品中，造成蛋白质含量较高的假象，以获得更高利润，却造成了诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉及鸡蛋中检出三聚氰胺等严重食物安全事故，造成严重的社会影响。
研究表明三聚氰胺能导致小鼠膀胱肿瘤，是一种潜在的致癌物质，在水中分解成氰尿酸，动物身体无法转化这种物质，在肾脏通过其分子结构上的氢氧基与氨基之间形成不溶于水的大分子氰尿酸三聚氰胺，大量氰尿酸三聚氰胺聚集于肾脏形成结石，造成肾小管的阻塞，导致尿液无法顺利排除，使肾脏积水，最终导致肾脏衰竭，严重将导致死亡。
高效液相色谱法测定乳粉中三聚氰胺的方法优化
高效腋相色谱法测定乳粉中三聚氟服的方法优化■文丨卢竹阳沈蕾陈丹莹柏宁江苏省南通市产品质量监督检验所二聚気胺含氮量高，俗称“伪蛋白”，几乎无味，微二^溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甲醛等，经常被用作化工原料，对健康有害，我国明确规定三聚氟胺不是食品原料，也不是食品添加剂，禁止人为添加。
“三鹿奶粉”事件影响恶劣，也给食品检验机构敲响警钟，三聚氧胺参数在乳品检测中成了必检指标，研究其检测方法尤为重要。
GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氧胺检测方法》明确规定，测定三聚気胺有三种方法，即液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法前两种方法涉及的仪器高端精密，费用昂贵，后续维护保养较为繁琐，不具备普遍性，本文对高效液相色谱法检测乳粉中三聚氧胺的前处理和色谱条件进行了优化。
一、材料和方法1.仪器。
Agilent-1200高效液相色谱仪（VWD）,多功能氮吹仪，高速冷冻离心机，数控超声波清洗器，电子天平（I级），固相萃取联用仪，SPE小柱：Poly-Sery MCX,60mg/3mL o2.试剂。
三聚氟胺标样（1.0mg/mL）,甲醇、乙睛、正己烷均为色谱纯，柠檬酸、辛烷磺酸钠、氨水、三氯乙酸均为分析纯。
3.样品前处理。
（1）提取"准确称取lg乳粉置于50ml具塞离心管中，加入8ml三氯乙酸溶液（1%）和2ml乙睛,超声提取约lOmin,涡旋提取约lOmin,9500r/min离心8min,取上清液于50ml离心管中；残渣重复提取一次，合并两次提取液，加入10ml三氯乙酸溶液和饱和的正己烷溶液，涡旋振荡lmin,9500r/min离心6min,取下层清液，待净化.（2）净化"依次用3ml甲醇和5m冰对SPE小柱进行活化和平衡，抽至近干；将待净化的清液转至SPE小柱中，用3ml水和3ml甲醇进行淋洗，抽至近干；用6mL氨化甲醇溶液（5%）洗脱，洗脱液于5（TC氮气吹干，残留物用lml 流动相定容，涡旋混合lmin,过0.22|xm微孔水相滤膜后，供测定。
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法
原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法（1）执行标准：《GB/T22388-2008原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法》（2）方法及谱图1液相色谱检测方法样品前处理：称取2g试样于50ml具塞离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液、5ml乙腈溶液和5%醋酸铅溶液（质量比）2ml，超声提取10min，再震荡提取10min后，以5000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容到25ml，移取5ml滤液，加入5ml水混合均匀后，全部上样。
净化处理：活化：5ml甲醇、5ml水依次活化固相萃取小柱上样：将全部待净化液以1ml/min的流速通过固相萃取小柱淋洗：依次用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取小柱，淋洗完毕后，抽至近干洗脱：用6ml5%氨化甲醇(v/v)(5%氨化甲醇：5mL氨水+95mL甲醇)溶液以1ml/min，洗脱液于50℃下氮气吹干，残渣用1ml流动相定容，涡旋混合1min，0.45μm过滤。
色谱条件：色谱柱：Venusil TM XBP C8(L)4.6×250mm，5μm流动相：缓冲盐溶液-乙腈=85:15缓冲盐配制：准确称柠檬酸2.10g和辛烷磺酸钠2.16g，加入约980ml水溶解，调节pH到3.0后，定容至1L紫外检测器波长：240nm；流速：1ml/min；进样量：20μL三聚氰胺标准品牛奶中的三聚氰胺2液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）样品前处理：称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入8ml三氯乙酸溶液、2ml乙腈溶液和5%醋酸铅溶液（质量比）2ml，超声提取10min，再震荡提取10min后，以5000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
净化处理：活化：5ml甲醇、5ml水依次活化固相萃取小柱上样：将全部待净化液以1ml/min的流速通过固相萃取小柱淋洗：依次用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取小柱，淋洗完毕后，抽至近干洗脱：用6ml5%氨化甲醇(v/v)(5%氨化甲醇：5mL氨水+95mL甲醇)溶液以1ml/min，洗脱液于50℃下氮气吹干，残渣用1ml流动相定容，涡旋混合1min，0.45μm过滤。
奶粉三聚氰胺事件折射出的相应的国家标准的改进方法等课件
• 四、政府或认证机构应将重点任务放在制、 修订涉及环保、安全、卫生的强制性国家 标准上。对于推荐性标准可以在标准申请 方面简化程序，但在编制程序、审查程序、 技术把关程序中，应更加认真、更加严格 以确保国标的一致性、系统性。
奶粉“三聚氰胺”事件折射出的相 应的国家标准的改进方法等课件
1 1 0.21
• 1 1202.、09福(完鼎) 市晨冠乳业奶有应粉的限“国公三家聚司标氰准生胺的”产改事进的件方折聪法射等尔出课壮的件相牌婴幼儿配方乳粉
奶粉“三聚氰胺”事件折射出的相 应的国家标准的改进方法等课件
奶粉“三聚氰胺”事件折射出的相 应的国家标准的改进方法等课件
被肾结石折磨的婴儿
奶粉“三聚氰胺”事件折射出的相 应的国家标准的改进方法等课件
未注意混合毒性
傅仙罗表示，几种食品添加剂混合摄入也可 能产生毒性。如将人工合成的化学添加剂 红色2号、海棠素、双晶60同时摄入，就会 产生严重的毒性反应。但混合毒性反应试 验成本很高，将1500多种食品添加剂作不 同的组合试验，将是多么大的工作量。
奶粉“三聚氰胺”事件折射出的相 应的国家标准的改进方法等课件
个标准相互打架
全国政协委员任启兴指出，目前我国食品 工业国家标准有1070项，食品工业行业标 准1164项，进出口食品检验方法行业标准 578项。
但在实际工作中，国家标准、行业标准 指标不一，执法部门监管无所适从。 同时，我国农业、质检、工商、卫生等各部 级单位都可以各自制定食品标准，互相矛 盾、交叉重复，难免会有“打 象出现。
• 五、新国家标准制、修订后应对相关质量 监督检验部门的检测能力、检测工具做出 规范。特别是对采用新技术、新工艺、新 资源、新方法，要进行正确的评估。通过 国家标准公益类项目等课题，逐步改进和 完善缺乏技术措施支撑、检测体系不配套、 关键检测技术和设备落后等状况。
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• Iron Source：ESI+；Capillary：4kV； Time(min) 0.0 1.0 2.0 4.5 4.6 8.0
A%
95 95 50 50 95 95
• Fragmentor：105；delta EMV：300；
• Gas Temp：110 ℃； Gas Flow：11L/hr；
浓度 （ng/mL）
2 5 10 20 10
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3．色谱条件
• 仪器型号：Agilent 1200-6410 LC/MS (08JL016)
• 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC 1.7 μm
• 流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5
μL；
• 流动相：A醋酸铵水B乙腈；梯度洗脱；
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检出限
• HPLC/MS/MS：0.01 mg/kg • HPLC:2mg/kg
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检测流程：
称样2.00 g, 准确加入0.2 mol/L高氯酸溶液9.8 mL、 0.2 μg/mL三聚氰胺内标溶液0.2 mL，均质，加入 10 mL二氯甲烷，振荡，4000r/min 离心5分钟，准 确移取5 mL上清液过混合性阳离子交换固相萃取 柱（用前用3 mL甲醇、3 mL水活化），分别用 3mL水和3mL甲醇淋洗柱子，再用3.0 mL 5%氨水 甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准 确加入乙腈+水（9+1）2.0 mL，涡旋振荡，洗脱 液用0.25 μm微孔滤膜过滤，上机测定。
• Nebulizer: 35psi。
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注意事项
每批检测样做样顺序为试剂空白、样品空白、样品加标、样品。 加标回收：移取0.2 mL，0.1 μg/mL标准溶液至样品中，相当于0.01
mg/kg添加水平，加入0.2mL 0.2 μg/mL内标工作液，初测加标要选 同等基质的样品做空白，样品复测做平行样，复测时如没有同等基 质的空白样品则直接在样品中加标，加标量为初测时样品中的含量 3倍，且加入内标量也应与三聚氰胺含量相当，样品提取液在过固 相萃取柱之前稀释到合适的范围，取稀释液过固相萃取柱，且应保 证最终上机工作液中内标的含量为10.0ng/mL . 检测结果无需校正回收率，检测结果应减去试剂空白。 每次检测结果应与标准谱图对照，如相同浓度标液峰面积偏差较大， 应及时查找原因；
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流程图
称样 2g 50 mL 离心管 均质
0.2 mol/L 高氯酸溶液 9.8 mL 0.2 μg/mL 内标溶液 0.2 mL 10 mL 二氯甲烷
振荡萃取，4000 r/min 离心 5 min
取水相（上层）5 mL 过柱（用前预活 化）
3mL 水和 3mL 甲醇洗涤柱子，弃去洗液 3mL5%的氨化甲醇洗脱柱子，收集洗脱液
• 升华温度：300℃；
• 溶 解 性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、 甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯 和四氯化碳，水溶液呈弱碱性
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化学性能
• 三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显 弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在 强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步 被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一 酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成 化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰 胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很 高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具， 防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂
GB/T22388 奶粉中的三聚氰胺检测液相色谱质谱法
2016.02.29
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1 性质
• 三聚氰胺：别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分 子 式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 ；分 子 量： 126.12
• 物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；
• 相对密度：1570kg/m³ ；
• 熔点：在常压下，354℃分解；
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三聚氰胺检测原理（LC/MS/MS）
• 标准中：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳 离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/ 质谱检测和确证，外标法
• 本实验室用0.2 mol/L高氯酸溶液提取，增加了 “样品经0.2 mol/L高氯酸溶液提取后加入10 mL 二氯甲烷萃取”,离心，取上层过柱，内标法定 量，固相萃取净化步骤同标准。
洗脱液于 50 ℃氮气吹干 2.0 mL 乙腈+水（9+1）洗脱、过滤，上机检测
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标准曲线配制
曲线浓度
2、5 、10 、20ng/mL(各含内 标10.0 ng/mL)
曲线工作液移取体源自 （mL）0.20.5 0.1μg/mL
1.0
2.0
内标0.2ug/mL 0.5
稀释至 10 mL