§7-1菌种的衰退、复壮分析
菌种的衰退.
----工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻 工业部食品发酵工业科学研究所, 南京(ID),真 菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP), 细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV), 病毒。/ ----抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)---中国医 学科学院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素 工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制 药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌 ----兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)农业 部兽医药品监察所,北京(CIVBP) 。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
----普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)--中 科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌;中科院武 汉病毒研究所,武汉(AS-IV), ----农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)---中国 农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF) ----工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻 工业部
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温理想的一种 方法。在低于-15℃下,快速将细胞冻结, 并保持细胞完整,然后在真空中使水分升 华致干。在此环境中,微生物的生长和代 谢都暂时停止,不易发生变异,故可长时间 保存,一般为5～10年,最多可达15年之久。 此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条 件,使微生物可以保存较长时间,但手续较 麻烦,需要一定的设备。
菌种的衰退、复壮和保藏
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微生物学
菌种的衰退、复壮和保藏（ 课时） 第八章 菌种的衰退、复壮和保藏（4课时）
食品教研室
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本 要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异； ）变异； b）污染； ）污染； c）死亡. ）死亡
一、菌种的衰退(degenration)
特点
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2.矿油保藏法
矿油 处理 灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
无菌检验 ？ 注入种管 口堵胶塞 淹没斜面约
3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 灭菌 接种 培养 装管
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理 以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法（以CICC为例） 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
b）通过寄主体进行复壮； 2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性， 维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮 积极措施) 广义复壮， 维护工作中不断筛选“正变”个体 广义复壮，积极措施 。
纯种的分离方法
平板划线分离法 平板涂布分离法 平板倾注分离法 用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
7食品微生物学
1、菌种的衰退与复壮
衰退：指由于自发突变的结果，使某物种原有一系列生物学性状发生 量变或质变的现象。
▲ 原有形态性状变得不典型了 ▲ 生长速度变慢，产生的孢子变少 ▲ 代谢产物生产能力下降——负变 ▲ 致病菌对宿主侵染力的下降 ▲ 对外界不良条件包括低温、高温等抵抗力下降
复壮：狭义的复壮指菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离筛 选少数尚未退化的个体。
常用菌种保藏法
生活态：连续在培养基上移种 休眠态：冷冻真空干燥法、砂土法、液氮保藏法
固体斜面、半固体琼脂柱、加甘油介质保藏法
广义的复壮指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常 采取纯种分离和生ຫໍສະໝຸດ 性状的测定等措施选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止
■ 控制传代次数 ■ 创造良好的培养条件 ■ 利用不易衰退的细胞传代 ■ 采用有效的菌种保藏方法
（2）菌种的复壮
平板表面涂布法
菌落纯（“菌种纯”） 平板划线分离法
■纯种分离法
琼脂培养基浇注法
用 “分离小室” 进行单细胞分离
细胞纯（“菌株纯”）
用显微镜操纵器进行单细胞分离
■通过宿主体复壮
用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
■淘汰已衰退的个体
2、菌种的保藏
原种：长期保藏的原始菌种。 菌种保藏的原理与方法： ■ 首先挑选典型菌种或典型培养物的优良纯种，最好选择其分生 孢子、芽孢等休眠体。 ■ 创造有利于菌种长期休眠的良好环境条件，如干燥、低温、缺 氧、避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等。 常用保护剂：甘油、二甲亚砜、海藻糖、脱脂牛奶等。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。
（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。
菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。
对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。
虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。
尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。
因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。
2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。
食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。
当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。
菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。
菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。
3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。
（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。
因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。
实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。
（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
发酵菌种：菌种退化的原因分析、预防措施及其复壮技术
发酵菌种：菌种退化的原因分析、预防措施及其复壮技术菌种在传代过程中，因遗传物质发生变异而引起的原有的优良性状渐渐消失或变坏，出现长势差、发酵效价不高、质量不好、菌落丛生等现象。
这些现象人们泛称为“退化”。
菌种退化是一个渐变的过程，发生有害变异的个体在群体中显著增多以至占据优势时才会显露出来。
因此尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现“退化”却需要较长的时间。
菌种退化的本质是染色体的变异，自然界中生物体发生变异是绝对的，如果这种变异朝着人们认为是坏的方向发展，就会造成退化。
菌种的整体性能，在不因外界因素而逐渐变差，且会遗传给下一代，就称为菌株退化。
需要注意的是，退化和老化是两个截然不同的概念。
菌种培育过程中随着菌龄的增加，养分不断消耗，菌种必然会出现老化现象。
菌体老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，细胞中空泡增多，甚至破裂。
老化的菌种接入培养基后表现为菌丝生长慢、抵抗杂菌能力弱、产酶能力下降等。
老化现象不会传给子代，这是与退化的最大区别。
所以，一旦菌株出现了异常现象，首先要分清是老化还是退化，或是单纯因为外界培养条件发生变化而引起。
如果是因老化或外界条件变化引起的异常, 采用新的培养基及适合的培养条件后菌株生长会恢复原状；如果是因退化而引起，则不会改变生长的恶劣状况，这时就要对菌株进行复壮。
本文将对菌种退化的原因加以简析，并给出相应有效的预防措施及复壮技术。
一．退化原因1有害突变及细胞遗传学原因根据细胞生物学观点，细胞变异和分裂速度密切相关，分裂速度越快，变异将会越多。
微生物由于分裂速度很快，分裂中的变异数量将会增加，而菌种退化与细胞变异密切相关。
据有关数据统计，通常每三百个细胞中，就会出现一个变异。
在多代传代繁殖中，变异概率将会更高。
当菌种遗传物质发生变异之后，突变体往往更能适应外界环境条件，变异的细胞再分裂，变异体将会越来越多，直到最后代谢能力完全退化。
2生理代谢方面的原因菌种制备时，菌体培养在特定的培养基上，这些培养基通常具备菌种生长、发育及繁殖所需的营养物质，如蛋白质、糖类、生长因子及水等。
§7-1菌种的衰退、复壮分析
❖ ①基因突变：如果控制产量的基因发生负突变，则 表现为产量下降。
❖ ②连续传代
❖ ③不适宜的培养和保藏条件：PH，温度，湿度。
3。菌种衰退的防止：
①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错
配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏 方法，可以减少移种和传代的数）；
②创造良好的培养条件； ③利用不易衰退的细胞移种传代（对丝状微生 ； 物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种） ④采用有效的菌种保藏方法。 ⑤讲究菌种选育技术 ⑥定期进行分离纯化
由此可见，狭义的复壮
菌种的复壮措施：
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注 法、单细胞挑取法等）。
②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化
条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退 个体）。
④采用有效的菌种保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体）
石蜡油封藏法* 沙土保藏法
冷冻干燥法
低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养
干燥、无氧、 低温、有保护
剂
各大类 细菌、酵母菌
各大类** 产孢子微生物
各大类
3~6月 6~12月 1~2年 1~10年
干法保藏菌种的方法
菌种复壮
防止菌种衰退的方法
（1）控制传代次数 （2）选择合适的培养条件 （3）利用不同类型的细胞进行传代 （4）选择合适的保藏方法
（1）控制传代次数
基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中， 繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生 变化的机会也就越多。因此应该尽量避免 不必要的接种和传代，把传代次数控制在 最低水平，以降低突变机率。一般情况下， 斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆 菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3 个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。 为此，生产菌种每移植一代，最好同时移 植较多的斜面，以供一段时间生产之需， 这样移植次数就可减少。
菌种的衰退、复壮与鉴定
文
震
微生物菌种的衰退与复壮
微生物具有生命活动能力，其世代时间一 般是很短的，在传代过程中易发生变异甚 至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退 化，并有可能使优良菌种丢失，所以，如 何保持菌种优良性状的稳定是研究菌种保 藏的重要课题。
菌种的衰退
菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后， 菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐 渐减退或消失的现象。
发酵工业菌种鉴定
细胞形态与习性水平 细胞组分水平 蛋白质水平 基因与核酸水平
经典分类鉴定
形态学特征 生理生化特征 血清学试验与噬菌体分型 氨基酸顺序与蛋白质分析
现代分类鉴定方法
微生物遗传型 DNA碱基组成 核酸分子杂交 遗传重组特性分析 RNA特性分析
现代分类鉴定方法
细胞化学成分特征分类 细胞壁化学组分 脂肪酸组成与磷脂成分分析 酯类及多胺的分析 醌类及多胺类的分析 可溶性蛋白的质朴分析
在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如 缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。 如粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)H2892菌株生产力为18g/L组氨酸，经5次传 代后因回复突变型增多，产量下降至4g/L。
菌种的衰退
每克耕作层土壤含菌量十倍递减
细菌（~108）
>放线菌（~107，孢子） >霉菌（~106，孢子） >酵母菌（~105） >藻类（~104）
>原生动物（~103）
二、水体中的微生物 1. 淡水微生物
1）数量和种类与接触的土壤有密切关系； 2）吸附于悬浮在水中的有机物上及水底； 3）多能运动，有些具有很异常的形态（例如柄细菌）； 4）靠近城市或城市下游水中的微生物多，并且有很多对健康 不利的细菌，因此不宜作为饮用水源； 5）水体自身存在自我净化作用： 水中的病原微生物会对水质产生重要影响
肠道中的正常菌群，大肠杆菌，一旦进入泌尿系统，引起尿路感染。 人体表面的正常菌群，一旦它们进入伤口也会引起感染。 条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位， 或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。
可通过口服某些活的微生物制剂 来治疗由于正常菌群失调而导致的腹泻。 •含蜡状芽孢杆菌（B.cereus）的“促菌生”， •含地衣芽孢杆菌的“整肠生”、 •枯草芽孢杆菌和肠球菌的“妈咪爱”、
上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染 并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。
“水花”或“水华”（water bloom）：
藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体(淡水水体)出现颜色， 并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。
赤潮或红潮（red tides）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。
饮用水的微生物指标： a）致病菌一般对营养要求苛刻，因此在一般的水中只能存活2~3天； 总菌数： < 100个/ml b）水表微生物会受辐射等作用而被杀灭； 大肠杆菌：< 3 个/L c）原生动物等的吞噬作用； d）由固形物吸附再沉积到水底；
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种的复壮与保藏(陈)
混合分装于冻存管内； • 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔
器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约510毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护 剂混匀后加入冻存管内； • 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌 种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突
变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞
数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
3、不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重 要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
➢低温保藏法
•方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
➢麸皮保藏法——曲法保藏。
• 措施：以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在 低温干燥条件下保存。
• 方法：麸皮：水＝1：（0.8～1.5） →湿热灭菌 →接种→干燥→低温保存
• 适用：产孢子的霉菌和某些放线菌 • 保藏期：1年～数十年
于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。
另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心
菌种的衰退、复壮和保藏
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法 采用的菌种保藏法： 采用的菌种保藏法
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism，中国微生物菌种保藏委员会） 中国微生物菌种保藏委员会） 中国微生物菌种保藏委员会
斜面传代法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法
赤潮或红潮（ 赤潮或红潮（red tides）： ）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花， 在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。 海水出现红色或褐色。
引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气危害养殖 业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡， 业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡， 因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同 不同的微生物往往对不同 的保藏方法有不同的适应性， 的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种 方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具 方法能被证明对所有的微生物均适宜 体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏 物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一 些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各 种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而 导致菌种的丧失。
微生物生态系统： 微生物生态系统： 微生物与其周围的环境（包括动植物） 微生物与其周围的环境（包括动植物）组成的具有一定 结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中， 结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中，微生物之 微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 间、微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 相互依存构成一个稳定的系统关系 。
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简便 简便 简便 简便 有效 简便 有效
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体）
石蜡油封藏法* 沙土保藏法
冷冻干燥法
低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养
干燥、无氧、 低温、有保护
剂
各大类 细菌、酵母菌
各大类** 产孢子微生物
各大类
3~6月 6~12月 1~2年 1~10年
❖ ②连续传代
❖ ③不适宜的培养和保藏条件：PH，温度，湿度。
3。菌种衰退的防止：
①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错
配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏 方法，可以减少移种和传代的数）；
②创造良好的培养条件； ③利用不易衰退的细胞移种传代（对丝状微生 ； 物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种） ④采用有效的菌种保藏方法。 ⑤讲究菌种选育技术 ⑥定期进行分离纯化
(3)菌种保藏的法 连续在活宿主上（内）移种
保
固体斜面
藏
湿法 半固体琼脂柱
方 休眠态
液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）
法
干法 藏在玻璃管内
吸附在合适的载体上
①低温保藏法 方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 ②石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。
模块一 菌种的衰退和复壮
一、 菌种的衰退
1.菌种衰退的现象
(1).菌种衰退是指由于自发突变的结果，而使某 物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变 的现象。常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降； 致病菌对宿主侵染能力下降； 对外界不良条件抵抗力减弱等。
由此可见，狭义的复壮
菌种的复壮措施：
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注 法、单细胞挑取法等）。
②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化
条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退 个体）。
④采用有效的菌种保藏方法。
二、 菌种的复壮 1、复壮
使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种 已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法， 从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型 性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有 意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种 的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地 从生产中选种
5.2、菌种保藏：
(1) 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
(2) 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分 生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度， 生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环 境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂 等）
❖ 2.菌种衰退的原因：
❖ 菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐 步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞 发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株 性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体 达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群 体表现为严重的衰退。
❖ ①基因突变：如果控制产量的基因发生负突变，则 表现为产量下降。
干法保藏菌种的方法
滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法）
冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 合适的载体 有机基质（曲料、麦粒）
滤纸片 薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）
血清蛋白小片（…乙烯薄膜… ）
国内外菌种保藏机构：
❖菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、
菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及 便于研究、交换和使用的目的。
❖菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
③干燥保藏法
将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保 藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌 保藏，保藏时间几至几十年。
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。
⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。