脉冲场电泳仪(KH—3.1).
脉冲场电泳仪参数
脉冲场电泳仪参数一、技术经济指标1、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对100bp-10Mb的DNA片段都能提供有效的分离。
2、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。
只要输入待分离DNA片段的最小、最大长度，结合10个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。
3、脉冲角度：可以在0-360°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒DNA的有效分离。
4、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。
5、多状态功能：在一个Block中可以有15个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现FIGE和CHEF两种技术。
6、二次脉冲功能：二次脉冲可加速DNA从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的DNA片段的分离，并可提高分辨率。
7、技术应用：CHEF（钳式均衡电场）技术，产生均衡电场；PACE（程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；FIGE（电场倒置）技术，为250KB以下小片断DNA提供快速分离；AFIGE（非对称场倒置）技术，精细分离小片断DNA，提高分辨率；以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。
8、性能指标：a. 电源输出：最高电压350V，0和0.6-9V/cm，0.1V/cm增量，连续可调b. 最大电流：0.5Ac. 延迟启动：最高72小时d. 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±0.5％e. 程序储存：存储20个复杂实验程序，每个程序包含8个程序模块或99个简单程序f. 数据记录：键盘，条形码读取或RS-232接口g. 显示屏：2行×40字符/行，荧光显示h. 转换范围：50毫秒到18小时i. 转换角度：0-360°，0.5°增量j. 电泳时间：最高999小时/模块k. 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定二、设备产地：国外三、参考品牌及型号：无四、资质要求：4.1投标人需在中华人民共和国境内注册，持有合法有效的企业法人营业执照。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
鸡源沙门菌的耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究
［ ］ 崔 尚金 ， 滟 平 ， ９ 全 李
［０ 徐绍建 ， １］ 李 俊， 曹
曦 ， 猪 圆 环 病 毒 间接 免 疫 荧 光 方 法 的 等．
帅 ， 猪 圆环 病 毒 ２型全 序 列 分 析 及 感 等．
建 立 ［］ 中 国预 防 兽 医 学 报 ，０ ７ ２ （ ） １ —０ Ｊ． ２０ ，９ １ ；９２ ． 染 性 克 隆 的 构 建 ［］ 中 国 兽 医 杂志 ，０ ９ ４ （ ） ２—２ Ｊ． ２ ０ ，５ １ ：１２ ． ［ １ 柳 美 玲 ， 晓 冰 ， 爱 华 ， ． 圆环 病 毒 ｚ 山东 分 离 株 全 基 １］ 秦 王 等 猪 型
１ ． ７
Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ，Ｉ ｅ ｔｆ ｃ ｔｏ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ Ａｎａ ｙ ｉ ｆ ｓ ｌ ｔｏ ｄ ｎ ｉｉ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｓ ｑ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ｏ Ｐｏ ｃ ｎｅ Ｃｉ ｃ ｖ ｒ ｓＴｙ ｒ ｍ ｇ ｎ Ｐｅ ｒ ｖ ｒ Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｒ ｏ ｉ ｕ ｐｅ ２ ｆ ｏ Ｐｉ ｓ ｉ ａ ｌＲｉ ｅ ｌａ Ａｒ ａ
动 物 医 学 进 展 ，０ １ ３ （ ） ９１ ２ １ ，２ ５ ：－３
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎ ｒ ｄ ｃｎｅ
鸡 源 沙 门菌 的 耐药 性 及 脉 冲 场 凝胶 电泳分 型研 究
董剑 辉 ， 惠 军 宋 立弘 ， 熊 ， 陈 瑞
Ｅ５ 董 信 田 ， 玉 峰 ， １３ 李 姜 平 ， 猪 圆环 病 毒 ２型 灭 活 疫 苗 的制 等．
备 与 免 疫 效 力 研 究 ［ ］ 畜 牧 兽 医 学 报 ，０ ８ ３ （ ） ： ３— Ｊ． ２ ０ ， ９ ５ ６ ９
６ ４ ４ ．
肺炎克雷伯菌耐药表型及分子分型特征分析
肺炎克雷伯菌耐药表型及分子分型特征分析熊流新; 陆丽苗; 梁启兰; 苏乐斌【期刊名称】《《检验医学与临床》》【年(卷),期】2019(016)016【总页数】4页(P2319-2322)【关键词】肺炎克雷伯菌; 耐药表型; 脉冲场凝胶电泳; 改良产碳青霉烯酶灭活试验【作者】熊流新; 陆丽苗; 梁启兰; 苏乐斌【作者单位】广东省肇庆市第二人民医院检验科广东肇庆526060; 广东省肇庆市疾病预防控制中心微生物科广东肇庆526060【正文语种】中文【中图分类】R446.5肺炎克雷伯菌(KP)是院内感染重要的条件致病菌之一，可引起呼吸道、泌尿道及血流感染等[1]。
近年来产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(产ESBLsKP)、耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌(CRKP)及多重耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)等不同耐药表型的KP在世界范围内发生流行性传播，临床可选择的抗菌药物极为有限[2]。
根据2017年中国细菌耐药监测网(CHINET)中国细菌耐药性检测报告显示，KP对亚胺培南的耐药率从2005年的3.0%上升至20.9%，而且CRKP在临床的分离率亦呈上升趋势[3]。
KP除了耐药性强的特点外，其高毒力也引起临床的极大关注。
高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)主要感染健康人群，导致社区感染，具有高黏液性、高侵袭性、高致死性等特点，HvKP合并MDRKP感染将给公共卫生防控和临床患者抗感染治疗带来极大挑战[4-5]。
本研究以肇庆市第二人民医院检验科微生物室分离的51株KP为研究对象，分析其耐药表型，并通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析其分子分型，以建立该院KP DNA指纹图谱数据库，为KP感染防控提供分子流行病学参考依据，现报道如下。
1 资料与方法1.1 一般资料收集2018年1-12月肇庆市第二人民医院检验科临床标本分离的非重复KP 51株，标本来自痰液、脓液、分泌物、血液等。
以KP ATCC700603作为质控菌株，大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218均购自广东省临床检验中心。
肠炎沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分型研究_李燕俊
根据食 源性疾病细菌 性病原所 致危害 的严重 性, 沙门氏 耐药性监测 培训 班提 供) 、营养 肉 汤 LB( 陆桥 公 司) 、溶菌 酶
菌应列为首选控制的食源性致病菌, 在沙门氏菌中, 肠炎沙门 ( Sigma 公司) 、蛋白酶 K( Merck 公司) 、PMSF( Sigma 公司) 、限制
件, 使 35~ 10000kb 的 DNA 分子在凝胶中 也得到有 效分离[2] 。 化板进行生化鉴 定, 确 定其为 沙门 氏菌属 后, 再按 GB47891 4-
用 PFGE 方法进行细菌分型鉴定可通过 限制性 内切酶 消化菌 94 用沙门氏菌分型血清进行确认, 选取其 中的肠 炎沙门 氏菌
株 DNA, 经 PFGE 分离, 比较 染色 体限 制性 内切 酶图 谱, 确定 进行以下实验。
菌株的亲缘关系。目前在一些发达国家, 已建 立了基于 PFGE 1121212 DNA 指纹图谱分型方法的建立
技术的细菌分子分型国家电子网 络( PulseNet) , 以便进 行食物 11212121 1 分离完整的 DNA 挑取单个菌落 , 接种于 3ml LB,
中毒的快速反应和预警。而 PFGE 方法 目前在 我国多 数应用 37e 振荡 培养 16h。12000rPmin 离 心 1min, 弃 上清, 加 细胞 悬
系方面, 脉冲场凝胶电泳是一种有效 的方法。
关键词: 肠炎沙门氏菌 PFGE 电泳 中图分类号: R155155 R18112 TS20713
文献标识码: A
Molecular analysis of Salmonella enteritidis by pulsed-field gel electrophoresis
Abstract: Objective To study the relationship between different strains of Salmonella enteritidis , a molecular epidemiologic analysis method- pulsed- field gel electrophoresis was established and Salmonella enteritidis isolated from food samples were tested. Methods Food samples were collected from henan province, heilongjiang province and other provinces in 1991- 20011 Strains were isolated and single colony of each salmonella enteritidis strain from an agar plate was picked and enriched, then the total DNA was extracted in turn with lysozyme solution, proteinase K solution and TE buffer. The agarose pulgs were digested with restriction enzyme Xba) overnight at 37e , followed by pulsed- field gel electrophoresis ( PFGE) with a CHEF Mapper system in 015 @ TBE buffer with recirculation at 14e . DNA macrorestriction fragments were resolved on 1% agarose gels, pulse time were ramped from 5s to 45s during a 26h run at 6VPcm. A lambda ladder pulsed- field gel maker was used as a size standard. Results 30 salmonella enteritidis strains were identified in chicken, beef, cooked meat and vegetables. 18 strains were isolated from henna province. More of the stains ( 22 strains) were isolated in 20011 Two distinct DNA fragment profiles, PFGE types A and B, were observed, representing 6313% and 361 7% of the isolates respectively. T ype A could be subdivided further into two subtypes. Subtype A1 represented the majority ( 7819% ) of type A strains and differed from subtype A2 in that the latter lacked a band in the 50kb region. There was no correlation between the strains profiles and their isolation time or reg ion. However , all the strains isolated from the chicken were totally type A1, and showed certain epidemiological trend which can be studied in the future. Conclusion The pulsed- field gel electrophoresis is a good method to study the molecular epidemiological relationship between the different Salmonella enteritidis srtains.
惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的主要基因类型
惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的主要基因类型目的探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的主要基因类型。
方法收集本地区临床各科室明确诊断为院内感染的标本，经分离获得大肠埃希菌483株，采用API 20E进行产ESBLs初筛，并参照CLSI文件M100-S22推荐的纸片表型确证试验进行确证。
对确证产ESBLss大肠埃希菌进行基因型检测和PFGE检测。
结果（1）API鉴定试剂条（API 20E）试验提示本研究所收集483例院内大肠埃希菌菌株中，产ESBLs阳性菌株共214例；确证试验结果提示，214例菌株均为产ESBLs阳性菌，符合率为100%；（2）214株产ESBLs大肠杆菌共有3种基因型和6种PFGE型，其中基因型TEM最多，共123株（57.5%），CTX-M51株（23.8%），SHV40株（18.7%）；PFGE图谱结果提示，3a和6a最多见，分别为70株和63株，其余分别为1a（30株）、2（21株）、4（18株）和18（12株）；（3）产ESBLs大肠埃希菌来源：214株产ESBLs大肠埃希菌，主要来源于重症监护室（118株）、血液科（39株）、呼吸科（34株），以及其他相关科室（共23株）。
结论现阶段本地区院内感染大肠埃希菌标本中，产ESBLs大肠埃希菌所占比例较高，其中以基因型TEM最多，PFGE型3a和6a最多见；病原菌主要来源于重症监护室、血液科和呼吸科。
标签：超广谱β-内酰胺酶；大肠埃希菌；院内感染；基因类型近年来，大量研究结果表明，随着广谱抗生素的广泛使用，院内感染发生率呈现出逐年增长的趋势，且院内感染与患者住院时间、住院费用以及院内死亡率紧密相关[1-2]。
大肠埃希菌是临床常见致病菌之一，由于抗生素的广泛使用，多重耐药大肠埃希菌已成为现阶段院内感染最常见的致病菌[3-4]。
多重耐药大肠埃希菌的流行，不仅给社会及患者带来了沉重的负担，还在一定程度上影响了医疗质量的提高。
由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta lactamases，ESBLs）是多重耐药大肠埃希菌广泛耐药的主要机制之一[5]。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
电泳仪设备简介
电泳仪电泳仪于1937年研发，常用支持物体有滤纸、醋酸纤维薄膜等。
电泳技术是分子生物学讨论不可缺少的紧要分析手段。
电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。
目录注意事项使用方法仪器原理注意事项1.电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。
同时要求仪器必需有良好接地端，以防漏电。
2.仪器通电后，不要临时加添或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。
3.由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至尽头所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
4.在总电流不超过仪器额定电流时（电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则简单影响仪器寿命。
5.某些特别情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必需先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，简单造成不必要的人为机器损坏。
6.使用过程中发觉异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立刻切断电源，进行检修，以免发生意外事故。
研发背景1937年，瑞典生化学家Tiselius集前人百余年探究电泳现象之大成，创造了Tiselius电泳仪，在此基础上建立了讨论蛋白质的自由界面电泳方法，利用该法首次证明人血清是由白蛋白（A）、α、β、γ球蛋白构成，并因此于1948年获得阿果奖。
随后电泳技术的进展突飞猛进，1949年，RicketlsMarrack等人证明人血清蛋白质经电泳分别可依次分为白蛋白，α1、α2、β、γ球蛋白五个组分，1957年Reiner对人血清五个组分蛋白进行了定量分析。
但自由界面电泳没有固定支持介质，扩散和对流作用较强，影响分别效果，于是在50时代相继显现了固相支持介质电泳。
《食品药品医疗器械检验机构仪器设备管理指南》
b．收集国内外有关仪器设备的信息和动态，组织相关 部门提出优化装备的建议；组织拟定仪器设备的购置、维护
6
组织体系
维修和计量计划； c．按规定对仪器设备的申购进行审批； d．负责组织和实施仪器设备计量管理工作； e．负责组织和实施仪器设备的调剂调拨、处置，以及共
3
术语
室通过实验确保仪器设备能够按照确认的规范正确安装和 运行。
2.8 OQ（Operational qualification，运行确认）：是指在所 有仪器设备预期操作范围内，实验室都能提供文件化的正常 操作鉴定过程材料。
2.9 PQ（Performance qualification，性能确认）：是指实 验室提供文件化的鉴定过程，来表明仪器设备持续稳定运行 且一定时间内仪器性能参数再现性满足技术规范要求。
2.4 供应商：是指向采购人提供仪器设备及其配件和服 务的法人和其他组织或者自然人。
2.5 计量：是指实现单位统一、量值准确可靠的活动。 2.6 DQ（Design qualification，设计确认）：是指实验室 基于仪器设备预期用途，对仪器设备的功能、操作标准和选 择供应商标准做出规定，并留下记录的过程。 2.7 IQ（Installation qualification，安装确认）：是指实验
1.4 本指南借鉴并遵循国家相关法律法规的要求。 1.5 仪器设备的配备要按照《全国药品检验机构基本仪 器配置标准（2011-2015 年）》、《全国医疗器械检验机构基本 仪器装备标准（2011-2015 年）》、《餐饮服务食品安全检验机 构技术装备基本标准（2011-2015 年）》、《保健食品检验检测 用仪器设备基本标准》和《化妆品检测用仪器设备基本标准 （2011-2015 年）》等相关标准实行优化配置的原则，且仪器
食品检验检测中心仪器设备配置标准
二氧化碳培养箱
2
1
1
51
三气细胞培养箱
1
1
1
52
摇床
10
5
1
53
超低温冰箱
2
1
1
54
多点接种仪
2
1
1
55
红外接种环灭菌器
8
4
1
56
全自动微生物平板螺旋加样系统
1
1
1
57
自动化革兰氏染色系统
1
1
1
58
全自动平板划线系统
1
1
1
59
培养基自动制备分装仪
1
1
1
60
倒置显微镜
1
1
1
61
显微镜
4
2
1
62
抑菌圈测量仪
1
153
氨基酸态氮测量仪
1
154
碘含量测量仪
1
155
甲醇测定仪
1
156
生物芯片检测系统
1
157
实时微生物荧光光电快速检测系统
1
158
食品微生物采样检测箱
1
159
食品安全便携式检测箱
1
160
微型离心机
1
161
车载电源转换器
1
162
便携式采样工具箱
1
163
二级生物样品安全转移箱
1
164
车载冷藏箱
1
冰柜
12
6
2
九
快检设备
140
生物毒素快速测定仪
1
1
1
141
抗生素残留检测仪
ERIC-PCR与PFGE检测铜绿假单胞菌同源性的方法学比较
ERIC-PCR与PFGE检测铜绿假单胞菌同源性的方法学比较孙晶;常军霞;刘巍【摘要】目的比较肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)与限制性内切酶联合脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测铜绿假单胞菌同源性的方法学一致性.方法分别用ERIC-PCR和PFGE对北京某医院48株铜绿假单胞菌株进行分型,明确其是否有克隆传播.结果 ERIC-PCR方法鉴定有34株为同一克隆来源,其余14株被分为9种基因型.PFGE方法分型鉴定有38株为同一克隆来源,其余10株表现为7种基因型,均提示脑外科内的铜绿假单胞菌在2010年存在一个克隆株传播.两种方法学结果的符合率为89.5％,PFGE重复3次结果相似度达96.6％,ERIC-PCR重复5次结果相似度达75.4％.结论 ERIC-PC操作简便快速,重复性较好,与PFGE结果一致性高,适合在基层医院进行细菌流行病学分析.%Objectives Compare the methodology consistency of PFGE and ERIC-PCR used in Pseudomonas aeruginosa homology detection. Methods Pulse-field gel electrophoresis (PFGE) and Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR) were performed respectively to detect molecular features of 48 pan-drug resistant Pseudomonas aeruginosa strains. Results In all, 34 strains were proved to be the same clone by ERIC-PCR, and the other strains were identified into 9 types; 38 strains were presented the same clone by PFGE, and the rest were classified into 7 types. The results showed that the same cloning strain was emerged in department of cerebral surgery in 2010. The coincidence rate of the two methods was 89.5%. PFGE had three repetitions, and the similarity was 96.6%; ERIC-PCR had five repetitions, and the similarity was 75.4%. Conclusion ERIC-PCR, with rapiddetection, good reproducibility and high consistency with PFGE, is easy and simple to handle. It is suitable for bacterial epidemiological analysis in primary hospital.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2013(038)004【总页数】6页(P297-302)【关键词】铜绿假单胞菌;脉冲场凝胶电泳;肠杆菌基因间重复一致序列PCR【作者】孙晶;常军霞;刘巍【作者单位】北京市通州区潞河医院,北京101149【正文语种】中文【中图分类】R378.99+1铜绿假单胞菌是条件致病菌，可引起医源性感染及医院内获得性肺炎。
脉冲场凝胶电泳实验流程
脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
肺炎克雷伯菌介导致碳青霉烯类耐药的基因检测研究
肺炎克雷伯菌介导致碳青霉烯类耐药的基因检测研究于亲德;徐平;于勇文;王曙光;冯桂梅【摘要】目的：分析碳青霉烯类耐药型肺炎克雷伯菌的耐药性及耐药基因型。
方法分离碳青霉烯类耐药型肺炎克雷伯菌14株，分别采用E-test实验、改良的Hodge试验、脉冲场琼脂糖凝胶电泳分型及多位点序列分型测定其耐药性、耐药基因型及主要流行序列型。
结果14株碳青霉烯类耐药型肺炎克雷伯菌对常用碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南呈中高度耐药，最低抑菌浓度(MIC)分别为8~64 mg/L、16~128 mg/L；对常见头孢类抗生素头孢哌酮、头孢西丁、头孢他啶和头孢吡肟均呈高度耐药，MIC 32~256 mg/L；对喹诺酮类药物环丙沙星呈中度耐药，MIC 3~32 mg/L；对氨基糖苷类抗生素阿米卡星不稳定，MIC<0.12~256 mg/L。
本组碳青霉烯类耐药型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型检测均为阳性，基因型属KPC-2；脉冲电泳分型显示A克隆2株、B克隆9株、C克隆3株，多位点序列分型显示ST119株、ST154株、ST4391株，分型结果基本一致。
结论碳青霉烯类耐药型肺炎克雷伯菌对部分其他种类的抗生素亦有较强耐药性，KPC-2型碳青霉烯酶是本院肺炎克雷伯菌产生青霉烯类耐药性的主要原因，主要流行克隆型和序列型分别为B型、ST11型。
%Objective To analyze the antibiotic resistance and genotype of Klebsiella pneumoniae (KNP) resistant to carbapenems. Methods 14 strains of Klebsiella pneumonia resistant to carbapenems were separated. The antibiotic re-sistance capacity, drug-resistant phenotype and genic sequence type were detected with E-test, reformative Hodge-test, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Results The MICs of KNP to imipen-em and meropenem were 8~64 mg/L and 16~128mg/L respectively, with moderate to high antibiotic resistance capacity to carbapenems. The antibiotic resistance capacities to cefoperazone, cefoxitin, ceftazidime and cefepime were all high with MIC of 32~256 mg/L, and to ciprofloxacin it showed a moderate antibiotic resistance capacity with MIC of 3~32 mg/L,while to amikacin, it is unstable with MIC of0.38~256 mg/L. All 14 stains of KNP could produce Klebsiella pneumoniae carbapenemase 2 (KPC-2). PFGE results showed cloning types of A (n=2), B (n=9) and C (n=3). Meanwhile, MLST re-sults showed ST types of ST11(n=9), ST15 (n=4) and ST439 (n=1). Conclusion Carbapenems-resistant KNP also resists to some other kinds of antibiotics, and KPC-2 is the primary cause of that resistance in our hospital, where the major epi-demic cloning and sequence types are type B and type ST11 respectively.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2014(000)017【总页数】4页(P2499-2502)【关键词】肺炎克雷伯菌;碳青霉烯酶;抗生素;耐药;基因检测【作者】于亲德;徐平;于勇文;王曙光;冯桂梅【作者单位】长沙市航天医院药剂科，湖南长沙 410205;中南大学湘雅医院附一医院药剂科，湖南长沙 410008;长沙市航天医院药剂科，湖南长沙 410205;长沙市航天医院药剂科，湖南长沙 410205;长沙市航天医院药剂科，湖南长沙410205【正文语种】中文【中图分类】R378.99+6肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KNP)与大肠埃希菌、阴沟肠杆菌并称为临床三大肠杆菌。
脉冲场电泳
脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶系统操作规范文件编号：VBQW11##-##版本号：A0制定：制定日期：审核：审核日期：批准：批准日期：颁发部门：质量保障中心发行日期：文件更改记录版本号发行日期变更原因、依据及详细变更内容制定人分发部门具体部门目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 操作规范 (4)4.1 简介 (4)4.1.1. 技术原理 (4)4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4)4.2 准备工作 (5)4.3 灌胶 (5)4.4 上样 (6)4.5 主机程序设置 (6)4.6 凝胶染色和观察 (6)4.7 电泳槽清理 (7)5. 注意事项 (8)6. 常见故障及解决方法 (8)7. 关于参数设置的几点建议 (9)8. 试剂配制 (11)1.目的指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。
2.适用范围本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。
3.职责分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。
4.操作规范4.1简介4.1.1. 技术原理常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。
但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。
实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。
脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。
PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。
严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。
电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。
通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。
图一. 脉冲场电泳交变示意图图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。
溯源技术
结果分析：
1.崇州36株宋内氏菌具有很高的同源性（包括病人分离株和可疑食 品分离株）,可确认该起食物中毒事件是由同一感染源引起的。
2.崇州和大邑分离得到的宋内氏菌株之间同源性较低，结合流行病 学调查，两起事件无联系。 3.大邑分离得到的宋内氏菌株之间分子分型不是完全一致，但优势 型（10/18）占绝大部分，可以判断该起事件是由宋内氏菌引起的 食物中毒事件。
PULSNET：统一的条件参数和Maker(伤寒H9812)，标
化后使得不同实验室的PFGE电泳图谱具备可比性,建 立网络—PULSNET-USA\ PULSNET-CANADA
应用溯源技术分析食物中毒突发事件的案例
案例1.
一起奇异变形杆菌食物中毒的PFGE图谱
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M
案例3.
2002年7月9日农民邹某家办生日宴，7人进餐，10日早相继发病，症状为 发热、腹痛、腹泻、呕吐等，其中邹某病情恶化，7月13日凌晨死亡。邹家7 月13日中午办丧宴请80多人进餐，继发33例患者。实验室在患者的肛拭、井 水、砧板拭子中分离出爪畦沙门氏菌，对分离的菌株进行RiboPrinter基因指 纹图谱分析,显示其高度同源,同源性达96.8%。可以推断这两次食物中毒均是 由被污染的井水引起的。
案例4.
2004年5月25日某公司4员工在食堂食用晚餐,可疑食物有凉拌蚝蚶、螺 肉等，于该晚11时30分出现首例病人，症状为脐周阵发性绞痛、腹泻、 呕吐、发热等。由于未采集到可疑食物，仅从3位病人肛拭中分离出副 溶血性弧菌。对分离的3个菌株进行RiboPrinter基因模式比对分析，同 源性达95.7%,可确认该起食物中毒事件是由同一感染源引起的。
脉冲电场凝胶电泳包括在琼脂糖凝胶中包埋菌体dna原位溶解用限制性内切酶消化染色体dna切割少许包含染色体dna片段的胶块并插入到凝胶孔中通过在电泳仪中预先设置好的模式不断改变电场方向进行电泳这些限制性片段在凝胶中被分离为不连续的电泳条带可以把不同分离株的dna限制性片段进行比较以确定其亲缘关系pfge1984年schwartz和cantor一原理二操作程序