实验三、血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

醋纤膜分离血清蛋白质的方法
以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端 加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后 再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的 区带，从正极依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
三、主要试剂与器材：
试剂：血清
巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液 器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（2×8cm） 血清加样器
（1）移液器的尖嘴：旁边不沾液滴； （2）移液器的尖嘴蘸点血清后，较快划一次。
3.搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两 端，其下端要浸入缓冲液中。注意：无光泽面朝 下；血清线不碰到盐桥上的滤纸；膜的+”“-” 与电泳槽的“+”极、“-”极方向一致。
Fra Baidu bibliotek
醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图
水平电泳槽
是从正极向负极移动；
当pH距离PI越远时，所带电量越多。
2.电泳分离血清蛋白质的原理
血清蛋白质的等电点为4.8～7.5，均低于8.6，因此电泳 时常采用pH8.6的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，在 电场中向正极移动。 由于各种血清蛋白的等电点不同，在同一pH下带的电荷 数也不同，加上各蛋白质的分子大小也有差别，因此在电场 中的移动速度不同。 带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、 相对分子量大的泳动较慢。 这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从 而可将血清蛋白分离成数条区带。
染色皿
+ 漂洗皿
五、结果与分析：
1.定性观察：指出薄膜上可显现清楚的五条区带分别 是什么？
吸水纸上：逐一摆开，找到自己的那条
六、注意事项：
1.点样时,毛面向上,要求样线粗细均匀，无明 显扩散现象。 2.搭桥时,光面向上,点样端置于负极,样线不 能接触滤纸。 3.正确连接导线(红色—正极，黑色—负极）。 4.电泳过程中，严禁再取放薄膜。
四、操作步骤：
1.浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中， 充分浸透后用镊子取出用两片滤纸吸干（约20min， 直到膜上没有斑点，中间没有气泡为止）。 2.点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约2cm处， 与边缘平行直线状点加3~5μL待分离血清。注意取 样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能 有明显扩散现象。
2cm
不同的点样方式

正确点样：直、细
+
姓 名
2cm
×错误的点样方式：量多、条带粗
+
姓 名
2cm
×结果：
-
+
×错误的点样方式：量少，条带不清晰
+
姓 名
2cm
×结果：
-
+
如何正确点样：
血清的高度：决定 尖嘴液面的高度→ 决定血清线漫开的 宽度。
1～3mm宽的细长、均 匀、连续条带
-
+
姓 名
2cm
4.醋纤膜分离血清蛋白质的原理
醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支 持物的一种电泳技术。 醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤 维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强， 对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用 样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围 广，快速简便 ,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸 溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。 因此，目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。
4.电泳：红正黑负。 电压：100V。 电泳时间约 60min 。 每人只能放一张膜，最后有空位才可放第二张膜
-
+
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+
5.染色：氨基黑10B, 染色3～5min. 镊子夹膜的两边，不夹中间 浸泡时，一条一条地浸，确保每条膜都被 染色液完全包裹
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+
6.漂洗：在装有漂洗液的2个漂洗缸中，依次 漂去多余染料，直到背景漂白为止。 尽量滴干染色液 一条一条地移 漂洗液的作用：洗去未结合蛋白质的游离 染料。
EQ v 6r

（i）粒子所带电荷越多，半径越小，泳动速度就越快
（ii）所带电荷越少，半径越大，泳动速度就越慢

2.电泳分离蛋白质的原理
COOH Pro NH3 +
pH
– COO– pH COO Pro Pro NH3 + NH2
碱性电离
pI
酸性电离
当pH=PI时，所带电荷为0，粒子是静止的； 当pH>PI时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向 是从负极向正极移动； 当pH<PI时，碱性电离，结合氢离子，带正电，运动方向
实验三
血清蛋白质
醋酸纤维素薄膜电泳
实验时间：第11周，星期一 注意：自己带铅笔、尺子
一、实验目的
1.了解电泳的基本原理； 2.掌握电泳分离蛋白质的原理； 3.掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。
二、实验原理
1.电泳的基本原理
电泳——是带电质点在电场力作用下发生定 向移动的现象。 电泳技术——是利用电泳现象进行物质分离、 纯化及鉴定的技术。
电泳速度的方向：
正 极 F´

–
F
负 极
电泳速度的大小：当F=F'时，粒子在电场中匀速运动。
电场力 F=QE 摩擦力 F´= 6πrV
F= F´
QE= 6πrV
运动速度
QE V = 6 π r
EQ v 6r
E：电场强度;
Q：粒子所带的净电荷;
r：粒子半径；
η：溶液的粘度
在同一电场环境中，带电粒子的迁移速率只与本 身所带电荷、粒子半径有关。