鼠疫实验室检测技术课件

• 检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛 用于实践。基本原理均为夹心法。
• 双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗 (F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另一株单 抗(金标-F1McAb)显色。
• 双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原 (F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的F1抗原(金标F1Ag)显色。
• 夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋标本中的相 应抗体＋金标记的SPA显色。
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GICA双抗体夹心法—测抗原
标本
G区：金标特异性抗体 (鼠型F1McAb)
T区：特异性单 克隆抗体
(F1McAb)
吸水纸
C区：羊抗 小鼠Ig
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免疫荧光技术(IFT)
• 标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 FITC)
入底物OPD蔽光反应30min后加终止 底物OPD蔽光反应30min后加终止液。
液(2mol/L硫酸)。
双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊
间接法： 已知F1抗原包被反应板， 断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫血
加标本37℃反应1h洗板，加入酶标 二抗37℃反应1h洗板，加入底物(如
清特异性抗体( F1Ab)包被反应板，加 标本37℃反应1h洗板，加小鼠F1McAb
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一、鼠疫菌菌体形态检查
• 典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2µm，宽0.5~0.7µm, 中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌， 有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。
• 染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片， 可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本 中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染 材料极有价值。
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间接红血球凝集试验(IHA)
• 鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化 处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原 致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试 验方法和结果判定均为常规操作。
• IHA微量法结果：
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反向血球凝集试验(RIHA)
• 用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1 抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。
• Yersinia pestis 免疫荧光染色
• 荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰酸 荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。
• 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美 兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染 色（菌体染成色，荚膜染成色）
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鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
• 革兰氏染色
• 美兰染色
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鼠疫菌染色
• 鼠疫菌涂片的革兰氏染色
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鼠疫菌染色检查
• Wayson stain(魏申氏染 • 荚膜染色—墨汁负染色 色)呈现的两极浓染特征
• 鼠疫噬菌体试验
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三、鼠疫F1抗原、抗体检测
• 鼠疫F1抗原检测 1.反向血球凝集试验(RIHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 4.免疫荧光技术(IFT)
• 鼠疫F1抗体检测 1.间接血球凝集试验(IHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA)
➢鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作 细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右即 可获得结果。
➢分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫 菌。
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鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
• 典型鼠疫菌菌落形态
• 噬菌带
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鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
• 鼠疫菌培养特征
OPD或TMB)蔽光反应30min显色后 液37℃静置1h洗板，加HRP标记的羊
加终止液。
抗小鼠IgG 37℃反应1h洗板,加底物
用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔 OPD蔽光反应30min显色，加终止液。
的吸光度值(A)
肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的
吸光度值(A)
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胶体金免疫层析法(GICA)
• RIHA微量法结果：
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酶联免疫吸附试验(ELISA)
• 测抗体.
• 测抗原
双抗原夹心法：F1抗原包被反应板， 加入待测标本28℃反应1.5h洗板，加 入HRP-F1抗原28℃反应1h洗板，加
双单抗夹心法： F1-McAb包被反应板， 加入标本28℃反应1.5h洗板，加入 HRP-F1McAb 28℃反应1h洗板，加入
鼠疫实验室检测技术
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鼠疫实验室检测
• 针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测： 鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试 验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒 力测定等。
• 针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗 体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。
• 针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测； 鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测 定；插入序列的检测。
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二、鼠疫菌的培养特性
鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃，最适
pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为 100~150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落， 一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和 分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受 70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆 形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒， 周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。
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鼠疫噬菌体试验
➢在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴 于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线 自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。
➢在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假 结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异 性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。