基因工程第7章 外源基因的表达1(原核表达)
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一、原核生物基因表达的特点 二、原核生物基因表达的调控序列 三、几种类型的原核表达载体 四、提高基因表达效率的途径
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一、原核生物基因表达的特点
① 只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识 别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ② 基因的表达是以操纵子为单位的。操纵子是 数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一 个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个 部分：操纵基因(operator)、启动子(promotor) 及其他有调控功能的部位。
第七章 外源基因的表达 及优化策略
基因的表达
DNA→RNA→蛋白质
原核生物中基因的表达
操纵子 转录 ↓
多顺反子mRNA 翻译 ↓ 多肽
真核生物中基因的表达
基因 ↓ 转录 前体mRNA 转录后加工↓ 成熟mRNA 转运，翻译 ↓ 蛋白质前体 翻译后加工 ↓ 成熟蛋白质
第二节 外源基因在原核细胞中的 表达
Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的
在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源 基因
它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是 由trp启动子的-35区、lacUV5启动子的-10区、操纵 基因及S-D序列组成
tac启动子之后是一个取自 pUC8的多克隆位点（MCS） 定位在启动子和S-D序列后 在MCS下游的一段DNA序 列中，还包含一个很强的核 糖体RNA的转录终止子，目 的是为了稳定载体系统 载体的其余部分由 pBR322组成。
将宿主菌的生长和质粒的复制分开
当宿主菌迅速生长时，抑制质粒的复制；当宿主菌 生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的 复制，增加质粒的拷贝数，拷贝数的增加必然导致外 源基因表达水平的提高。
质粒pCl101是温度控制型诱导DNA复制最好的例子。 用此质粒转化宿主菌，25 ℃ 时宿主中仅有此质粒10拷 贝，宿主细胞大量生长；但当温度升高到37 ℃ 时，质 粒大量复制，每个细胞中质粒拷贝数可高达1000个。
2、融合型蛋白的表达
将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接 在一起，并作为一个开放型阅读框进行表达。由 这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白 在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端， 异源蛋白位于C端。 通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位 点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯 化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白
三、几种类型的原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计 的不同，总的来说可产生融合型和非融合型表 达蛋白。 不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达 蛋白称为非融合蛋白。 融合蛋白是指蛋白质的N末端由原核DNA序列 或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整 序列编码。
非融合蛋白
如应用tac启动子时，常将lacI基因克隆在表达质粒中。当宿主 菌生长时，lacI产生的阻遏物与lac操纵基因结合，阻碍了外源 基因的转录及表达，此时，宿主菌大量生长。当加入诱导物(如 IPTG)时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转 录并高效表达。 一般采用温度诱导或药物诱导
(2) 表达载体的诱导复制
仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的 许多因素，诸如启动子的强度、DNA转录起 始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、 转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性 和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影 响到外源基因的表达效率
1、启动子结构对转录效率的影响 受检启动子的强弱与它们的一致序列（即与-10 和-35区序列）相似的程度成正比 -35和-10区之间的距离也是一个重要因素。如果 间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于 17个碱基对，启动子表现较弱
3、终止子
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3 ’ 端 往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转 录的功能，这一DNA序列称为转录终止子 (terminator)。 共同的特点，即有一段富含G／C的区域 （转录后的RNA可形成茎环结构）和一段 富含A/T的区域（形成的DNA/RNA双链为 A-U配对，易解离）。
5、质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响 由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是 大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途 径之一是增加相应的mRNA分子的数量 提高启动子的强度（采用强启动子） 提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上）
6、减轻细胞的代谢负荷
（1）诱导表达
使细菌的生长与外源基因的表达分开，是减轻宿主细 胞代谢负荷的最为常用的一个方法
3、启动子同克隆基因间距离对翻译效率的影响
措施： 起始密码子和S-D序列之间的距离必须接近到一定程度（7 个核苷酸时最合适）
4、转录终止区对克隆基因转录效率的影响
在克隆基因的末端，存在一个转录终止区是十分重要的。
在基因内部的适当位置上存在着转录的终止 区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基 因的表达效率)控制在一个正常的水平上。
融合型蛋白表达载体pGEX系统
由Pharmacia公司构建 由3种载体pGEX-lXT，pGEX-2T和pGEX-3X 以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质 Glutathione Sepharose 4B组成。 含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI 阻遏蛋白基因等。 与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是 谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基 因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。
外源基因表达产物在细胞质中过度积累会影 响细胞的生理功能，并给后续的分离纯化带 来一定的困难。将外源基因的产物以分泌的 形式来表达这可以解决上述问题。 分泌型：可简化后期的纯化工艺，减少外源 蛋白被蛋白酶降解的概率，也能够形成正确 的空间构象
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
四、提高基因表达效率的途径
原核生物的核心启动子
-10区：DNA局部解旋
core promoter
-35区：RNA聚合酶的初始识别及结合部位
原核生物典型的启动子包括三个元件：-35区、-10和转录 起点 （startpoint）。
启动子有强弱之分 真核基因要在原核表达系统中被转录，
必须将其克隆在原核启动子的下游
常用的可调控的强启动子有lac
pGEX-2t原核表达载体
3、分泌型表达外源蛋白
优点： 目的蛋白稳定性高：高重组人胰岛素原若分泌到 细胞外，其稳定性大约是在细胞质中的1100倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白 N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在 大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基 往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的 信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达， 其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程 中被有效除去
(乳糖启 动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ 噬菌体的左向和右向启动子)以及tac （乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。
2、SD序列
• mRNA在细菌中的翻译效率 依赖于是否有核糖体结合位 点的存在，即S-D序列以及 S-D序列与起始密码子AUG 之间的距离
• 在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多 或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的 ，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。
③ 原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联 的，也是连续进行的。原核生物染色体DNA是 裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在 胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。 ④ 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原 核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因 此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞 中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能 被切除。
优点在于它具有非常接近于真核细胞体内蛋白 质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更 接近于生物体内天然蛋白质。 最大缺点是易被细菌蛋白酶破坏。 为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可 将带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启 动子和SD序列的下游，经转录翻译，得到非融 合蛋白。
融合蛋白
由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和 真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。 稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解 易于分离纯化 表达融和型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅 读框架应与融和的DNA片段的阅读框架一致， 翻译时才不至于产生移码突变。
1、非融合型表达蛋白载体pKK223-3
二、原核生物基因表达的调控序 列
对原核生物来讲，基因表达的调控
序列主要涉及启动子、S-D序列、终 止子等序列。
1、启动子
DNA链上一段能与RNA聚合酶结合
并能起始mRNA合成的序列（使转 录开始的部位），没有启动子，基 因就不能转录。
启动子的特性
序列特异性： 在启动子的DNA序列中 ，通常含有 几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致 转录启动的滞后和转录速度的减慢。 方向性： 具有方向性的顺式调控元件，正反两个 方向中只有一种具有启动功能。 位置特异性： 只能位于所启动转录基因的上游或 基因内的前端。 种属特异性：原核生物的不同种、属，真核生物 的不同组织具有不同类型的启动子。亲缘关系越 近的两种生物，其启动子通用的可能性较大
融合蛋白表达质粒的构建原则
受体细胞的结构基因能高效表达，且其
表达产物可以通过亲和层析进行特异性 简单纯化 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下 游，为融合蛋白提供终止密码子。 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅 读框架
常见的用于融合蛋白构建的受体蛋白
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象TrxFus 麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌 β-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控 制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合 成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控 制)，二是终止控制(衰减子控制)。 ⑥ mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密 码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序 列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
外源基因在原核细胞中表达条件
①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白； ② 外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或 全化学合成基因，而不能用基因组DNA； ③ 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控 元件控制外源基因的表达； ④ 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框(open reading frame，ORF)； ⑤ 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
采取措施： 采用强启动子 -35和-10区之间保持的距离（16～19bp）
2、翻译起始序列对翻译效率的影响
连接在S-D序列后面的4个碱基成分的改变会对翻译效率发生很 大的影响。 如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其翻译作用最为有效； 这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高 转译效率的50％或25％。 直接位于起始密码子AUG左侧的密码子的碱基组成，同样也会 对翻译的效率发生影响。 措施： 确定合适的SD序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游 的碱基成分
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一、原核生物基因表达的特点
① 只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识 别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ② 基因的表达是以操纵子为单位的。操纵子是 数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一 个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个 部分：操纵基因(operator)、启动子(promotor) 及其他有调控功能的部位。
第七章 外源基因的表达 及优化策略
基因的表达
DNA→RNA→蛋白质
原核生物中基因的表达
操纵子 转录 ↓
多顺反子mRNA 翻译 ↓ 多肽
真核生物中基因的表达
基因 ↓ 转录 前体mRNA 转录后加工↓ 成熟mRNA 转运，翻译 ↓ 蛋白质前体 翻译后加工 ↓ 成熟蛋白质
第二节 外源基因在原核细胞中的 表达
Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的
在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源 基因
它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是 由trp启动子的-35区、lacUV5启动子的-10区、操纵 基因及S-D序列组成
tac启动子之后是一个取自 pUC8的多克隆位点（MCS） 定位在启动子和S-D序列后 在MCS下游的一段DNA序 列中，还包含一个很强的核 糖体RNA的转录终止子，目 的是为了稳定载体系统 载体的其余部分由 pBR322组成。
将宿主菌的生长和质粒的复制分开
当宿主菌迅速生长时，抑制质粒的复制；当宿主菌 生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的 复制，增加质粒的拷贝数，拷贝数的增加必然导致外 源基因表达水平的提高。
质粒pCl101是温度控制型诱导DNA复制最好的例子。 用此质粒转化宿主菌，25 ℃ 时宿主中仅有此质粒10拷 贝，宿主细胞大量生长；但当温度升高到37 ℃ 时，质 粒大量复制，每个细胞中质粒拷贝数可高达1000个。
2、融合型蛋白的表达
将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接 在一起，并作为一个开放型阅读框进行表达。由 这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白 在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端， 异源蛋白位于C端。 通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位 点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯 化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白
三、几种类型的原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计 的不同，总的来说可产生融合型和非融合型表 达蛋白。 不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达 蛋白称为非融合蛋白。 融合蛋白是指蛋白质的N末端由原核DNA序列 或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整 序列编码。
非融合蛋白
如应用tac启动子时，常将lacI基因克隆在表达质粒中。当宿主 菌生长时，lacI产生的阻遏物与lac操纵基因结合，阻碍了外源 基因的转录及表达，此时，宿主菌大量生长。当加入诱导物(如 IPTG)时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转 录并高效表达。 一般采用温度诱导或药物诱导
(2) 表达载体的诱导复制
仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的 许多因素，诸如启动子的强度、DNA转录起 始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、 转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性 和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影 响到外源基因的表达效率
1、启动子结构对转录效率的影响 受检启动子的强弱与它们的一致序列（即与-10 和-35区序列）相似的程度成正比 -35和-10区之间的距离也是一个重要因素。如果 间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于 17个碱基对，启动子表现较弱
3、终止子
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3 ’ 端 往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转 录的功能，这一DNA序列称为转录终止子 (terminator)。 共同的特点，即有一段富含G／C的区域 （转录后的RNA可形成茎环结构）和一段 富含A/T的区域（形成的DNA/RNA双链为 A-U配对，易解离）。
5、质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响 由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是 大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途 径之一是增加相应的mRNA分子的数量 提高启动子的强度（采用强启动子） 提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上）
6、减轻细胞的代谢负荷
（1）诱导表达
使细菌的生长与外源基因的表达分开，是减轻宿主细 胞代谢负荷的最为常用的一个方法
3、启动子同克隆基因间距离对翻译效率的影响
措施： 起始密码子和S-D序列之间的距离必须接近到一定程度（7 个核苷酸时最合适）
4、转录终止区对克隆基因转录效率的影响
在克隆基因的末端，存在一个转录终止区是十分重要的。
在基因内部的适当位置上存在着转录的终止 区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基 因的表达效率)控制在一个正常的水平上。
融合型蛋白表达载体pGEX系统
由Pharmacia公司构建 由3种载体pGEX-lXT，pGEX-2T和pGEX-3X 以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质 Glutathione Sepharose 4B组成。 含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI 阻遏蛋白基因等。 与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是 谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基 因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。
外源基因表达产物在细胞质中过度积累会影 响细胞的生理功能，并给后续的分离纯化带 来一定的困难。将外源基因的产物以分泌的 形式来表达这可以解决上述问题。 分泌型：可简化后期的纯化工艺，减少外源 蛋白被蛋白酶降解的概率，也能够形成正确 的空间构象
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
四、提高基因表达效率的途径
原核生物的核心启动子
-10区：DNA局部解旋
core promoter
-35区：RNA聚合酶的初始识别及结合部位
原核生物典型的启动子包括三个元件：-35区、-10和转录 起点 （startpoint）。
启动子有强弱之分 真核基因要在原核表达系统中被转录，
必须将其克隆在原核启动子的下游
常用的可调控的强启动子有lac
pGEX-2t原核表达载体
3、分泌型表达外源蛋白
优点： 目的蛋白稳定性高：高重组人胰岛素原若分泌到 细胞外，其稳定性大约是在细胞质中的1100倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白 N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在 大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基 往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的 信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达， 其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程 中被有效除去
(乳糖启 动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ 噬菌体的左向和右向启动子)以及tac （乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。
2、SD序列
• mRNA在细菌中的翻译效率 依赖于是否有核糖体结合位 点的存在，即S-D序列以及 S-D序列与起始密码子AUG 之间的距离
• 在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多 或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的 ，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。
③ 原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联 的，也是连续进行的。原核生物染色体DNA是 裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在 胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。 ④ 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原 核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因 此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞 中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能 被切除。
优点在于它具有非常接近于真核细胞体内蛋白 质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更 接近于生物体内天然蛋白质。 最大缺点是易被细菌蛋白酶破坏。 为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可 将带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启 动子和SD序列的下游，经转录翻译，得到非融 合蛋白。
融合蛋白
由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和 真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。 稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解 易于分离纯化 表达融和型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅 读框架应与融和的DNA片段的阅读框架一致， 翻译时才不至于产生移码突变。
1、非融合型表达蛋白载体pKK223-3
二、原核生物基因表达的调控序 列
对原核生物来讲，基因表达的调控
序列主要涉及启动子、S-D序列、终 止子等序列。
1、启动子
DNA链上一段能与RNA聚合酶结合
并能起始mRNA合成的序列（使转 录开始的部位），没有启动子，基 因就不能转录。
启动子的特性
序列特异性： 在启动子的DNA序列中 ，通常含有 几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致 转录启动的滞后和转录速度的减慢。 方向性： 具有方向性的顺式调控元件，正反两个 方向中只有一种具有启动功能。 位置特异性： 只能位于所启动转录基因的上游或 基因内的前端。 种属特异性：原核生物的不同种、属，真核生物 的不同组织具有不同类型的启动子。亲缘关系越 近的两种生物，其启动子通用的可能性较大
融合蛋白表达质粒的构建原则
受体细胞的结构基因能高效表达，且其
表达产物可以通过亲和层析进行特异性 简单纯化 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下 游，为融合蛋白提供终止密码子。 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅 读框架
常见的用于融合蛋白构建的受体蛋白
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象TrxFus 麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌 β-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控 制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合 成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控 制)，二是终止控制(衰减子控制)。 ⑥ mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密 码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序 列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
外源基因在原核细胞中表达条件
①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白； ② 外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或 全化学合成基因，而不能用基因组DNA； ③ 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控 元件控制外源基因的表达； ④ 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框(open reading frame，ORF)； ⑤ 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
采取措施： 采用强启动子 -35和-10区之间保持的距离（16～19bp）
2、翻译起始序列对翻译效率的影响
连接在S-D序列后面的4个碱基成分的改变会对翻译效率发生很 大的影响。 如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其翻译作用最为有效； 这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高 转译效率的50％或25％。 直接位于起始密码子AUG左侧的密码子的碱基组成，同样也会 对翻译的效率发生影响。 措施： 确定合适的SD序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游 的碱基成分