实验三 红曲色素的提取

红曲霉菌是一种好氧性微生物, 除了能进行固体浅盘培养外, 还可 以用液体摇瓶培养的方法来获得种子。 液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培 养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。液体菌种应 用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌 发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵 的集约化、标准化生产创造了更好的条件。
具体方法：
1、称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中； 2、加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀, 60℃水浴保温萃取0.5h； 3、取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL； 4、以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。 5、计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505×lO×2
培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响
2. 温度和pH 虽然不同的红曲霉菌株其最适生长温度和最适生长pH有所不同， 但大多数菌株的适温为30～35℃，25℃以下或40℃以上生长缓慢。 最适pH为3.0～5.0，pH 3.0以下生长缓慢，pH5.0以上则不适于产 生色素。 3. 无机盐类 高浓度的CoCl2（10－4）、CuCl2（10－6）和ZnCl2（10－3） 对大多数红曲霉株的生长有抑制作用，低浓度的CoCl2（10－5）、 CuCl2（10－7）和ZnCl2（10－5）可促进色素生成。
红曲色素的提取
具体步骤：
1、取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；
2、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提 取液(丙酮 : 水 =80:20)200-300mL；
3、室温下摇动10-15min左右，过滤；
4、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分， 60℃ )；
5、用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL) 的pH至3.0, 加至分 液漏斗中；加入 150ml的醋酸乙酯 （EtOAc)分次抽提。
红曲固态发酵
固态发酵的定义：微生物在几乎没有游离可流动水的 培养基上的生长过程及生物反应过程。
影响红曲发酵的因素
（1）菌种：应选择生长快、适应性强、产红色素明显的菌株； （2）原料：一般选用无黏性的梗米或籼米，其淀粉含量高、营养丰富， 且可吸收适量水分。米的含水量对发酵影响很大，起始水分含量低，红 曲色素易生成；水分含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以25 %～30 %为宜； （3）补水：红曲霉在生长繁殖过程中，需要补充适量水分，尤其在生长 旺盛期补水显得更为重要； （4）湿度：空气相对湿度关系到水分的蒸发，对发酵的影响也很大，一 般RH控制在85 %以上； （5）温度：能在20～37℃范围内生长，通常冷却至30℃左右即可接种， 采用30℃发酵； （6）通气：红曲霉是一种好氧性微生物，因此培养过程中要注意保持良 好的通气。
实验三、红曲发酵及红曲色素 的提取
1
红曲霉菌 红曲 红曲色素
2
3
红曲霉菌
红曲霉菌是一种对人类有益的 真菌，红曲霉菌能使大米发酵制 成红曲米。 红曲霉菌菌丝具有横隔、多核、 分枝较多且不规律。 由红曲霉接种于大米发酵得到 的红曲是我国古代的一大发明， 称为丹曲，至今已有1000多年的 历史，很早就应用于食品着色、 食品发酵以及中医中药。
红曲固体发酵
红曲固体发酵
一、实验原理
红曲霉菌作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著 称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。 红曲的主要成分 1）红曲色素：黄色素、橙色素和紫红色素 2）活性酶 3）洛伐他汀（日本发现） 4）抑菌物质：桔霉素(Citrinin)等 国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵的方法。
注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。
四、注意事项 1. 无水 Na2S04 可回收, 反复使用, 不要扔掉。 2. 有机溶剂易燃, 注意远离火源, 原则上应在通风柜中进行。
五、思考题 : 1．为什么要用无水 Na2S04 脱水? 2．萃取后米粒中仍带有红色, 是否会对结果产生影响?
特性：



红曲菌是腐生真菌，生长的最适pH为3.5-5，能耐 pH3.5，尤嗜乳酸。 生长温度为26-42℃，最适温度为32-35℃；能耐 10%乙醇。 能合成生物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黄素等。 还能产生 及少量 等。红曲菌的液化型α-淀粉酶的活性弱，而糖化 型β-淀粉酶的活性较强，故可用来生产红色麦芽 糖。红曲菌的蛋白酶的活性较高。
补充点：培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响
1. 碳氮源和生长素
红曲霉能利用多种糖类生长，一般说来，淀粉、糊精、葡萄糖等都是 良好的碳源，而在对麦芽糖、蔗糖等的利用上各菌株间差异很大。另外， 适于红曲霉生长的碳源并不一定有利于色素的产生，如红曲霉Monascus sp.3.973菌株用合成培养基（糖5％，NaNO3 1％，KH2PO4 0.5%， MgSO4·7H2O 0.25％，FeCl3微量，150 mL三角瓶内装25 mL培养基）培 养时，若以麦芽糖为碳源，可得生物量（干重）0.1 g，稀释100倍后的 发酵液其吸光度（A505nm）为0.860；而以木糖为碳源时，生物量仅0.04 g，但是1%发酵液的吸光度（A505nm）可达1.850，说明生长与色素的产 生之间不呈正相关。 就氮源而言，NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和蛋白胨等都是红曲霉生 长的良好氮源，然而菌体生长与色素生成之间也不呈正相关。泛酸钙、 对氨基苯甲酸、维生素B6、肌醇等含氮物质具有促进某些菌株生长及色 素生成的作用。
工艺流程：
菌种→选育→斜面培养→摇瓶培养→液体种子发酵
大米→清理→浸泡→清洗→蒸饭→冷却→接种→固体培养→ 干燥→粉碎→红曲色素提取
红曲色素的提取及红曲色价测定
1
红曲色素的提取
2
红曲色价测定
红曲色素的提取
一般提取方法：
萃取法 组织培养法 粉碎法 压榨法 酶反应法 微生物发酵法 人工合成法
• • • •
• 1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备 液体种子。 • 2、了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。 • 3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素 色价的测定方法。
1
红曲液体菌种的制备
2
红曲固体发酵
3
红曲色素的提取及红曲色价测定
红曲液体菌种的制备 一、实验原理
红曲色素
红曲色素呈深紫红色 粉末，略带异臭，熔点为 165~192℃。 红曲色素中的脂溶 性色素均能溶于乙醇等有机溶剂。 常用的溶剂是乙醇和醋酸，红曲 色素含量低时其溶液呈鲜红色， 含量高时呈带黑褐色并伴有荧光 产生。对蛋白质的着色性能极好， 一旦染着，虽经水洗，亦不掉色。
红曲色素的特性：
• • • • 1 热稳定性 经研究证明，红曲色素的热稳定性较好，优于其他合成色素，在天然色素 中其耐热性能也属优良。 2 光稳定性 红曲色素的醇溶液受紫外线的影响较小，但日光能使色度降低。通过对红 曲色素中红、橙、黄3类色素光稳定性实验分析发现，红曲色素中红、橙、 黄3类色素间光稳定性差别很大，黄色素的光稳定性最强，其次为红色素， 橙色素对光最不稳定。 3 对其他物质的稳定性质 实践证明，红曲色素不受常见金属离子与氧化剂和还原剂的影响。 4 抗菌性 对食品中 54 种易污染的微生物进行抑菌试验证明：红曲色素对肉毒梭状 芽胞杆菌，蜡状芽胞杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄葡萄球菌、荧光假 单胞杆菌有较强的抑制作用。
第一次
第二次ห้องสมุดไป่ตู้
第三次
第四次
图一：红曲代谢产物分离工艺流程图
分工：
• 一组：配制提取液（丙酮：水=80：20）， • 二组：配制1mol/L HCl， • 三组：配制2mol/L NaOH, 1000ml； 500ml; 2000ml；
• 四组：配制Na2CO3(pH=9),
500ml;
红曲色价测定：
红曲色素
红曲色素是一种由红曲霉属的 丝状真菌经发酵而成的优质的天 然食用色素，是红曲霉的次级代 谢产物。 红曲色素，红曲色素分为黄 色素、橙色素和紫红色素。商品 名叫红曲红，是以大米、大豆为 主要原料，经红曲霉菌液体发酵 培养、提取、浓缩、精制而成， 或者是以红曲米为原料，经萃取、 浓缩、精制而成的天然红色色素。

红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、 葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。
红曲
红曲又名丹曲、赤曲、红曲 米，是以籼米为原料，经红曲霉 菌液体深层发酵精致而成，是一 种纯天然、安全性高、有益于人 体健康的食品添加剂。而且本品 色泽鲜艳、色调纯正是天然绿色 食品理想的着色剂。 它应用范围广泛，包括食品类 （肉制品、果汁、色酒、果酱、 饮料、糖果、糕点、酱油、保健 醋等）；药品类（药品着色剂、 功能性保健品）；化妆品类。