白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达_孙萍
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
HPLC 测定条件： C18 反相柱（ 5 μm，250 mm × 4. 6 mm） ，线性梯度洗脱，流动相在 25 min 内从 5% 乙腈， 95% 水 梯 度 变 ຫໍສະໝຸດ Baidu 到 70% 乙 腈，30% 水，流 速 为 0. 9 mL / min，进样量为 20 μL，检测波长 306 nm。采用面 积外标法进行定量测定。
将重组质粒 pGEM-T-T4C 和含有 G418 抗性基因 的载体 pRS42K 分别用限制性内切酶 BamHⅠ和 Xho Ⅰ进行双酶切，回收目的片段，在 T4 DNA 连接酶的
作用下，按摩尔数比为 3∶ 1，16℃ 连接过夜，转化大肠 杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定重组质 粒。重组质粒命名为 pRS42K-4CL。
白藜芦醇（ resveratrol） 是植物在受到生物或非生 物胁迫时，如真菌感染、紫外照射等，产生的一种能提 高植物抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素，主要 存在于各种浆果、花生以及药用植物 （ 如虎杖） 中。 白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老以及保护心血管 和调节雌激素等多种保健作用［1 － 5］，可在医药、食品、 化妆品等行业中广泛应用。在自然条件下，植物体内 的白藜芦醇含量非常低，且植物生长缓慢，白藜芦醇 的工业化生产面临着提取难，得率低，成本高等问题。 近年来，利用基因工程重组技术在微生物中高效表达 白藜芦醇成为研究热点。
2013 年第 39 卷第 8 期（ 总第 308 期） 7
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
盐，终浓度均为 200 mg / L。 1. 1. 3 酶和主要试剂
LA Taq 酶、Ex Taq 酶、T4 DNA 连接酶、各种限制 性内切酶等，购自 Takara 公司； 质粒 小 量 提 取 试 剂 盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒等，购自天根生化科 技有限公司； pGEM-T Easy 载体，购自 Promega 公司； 对香豆酸（ 纯度≧ 98% ） 购自阿拉丁试剂（ 上海） 有 限公司； 白藜芦醇标准品，购自广州齐云生物科技有 限公司； 乙腈、甲醇为色谱纯； 其他试剂均为国产分析 纯。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 4cl 基因和 rs 基因的克隆
分别提取拟南芥和巨峰葡萄叶子中的总 RNA， 根据已报道的 4cl 基 因 序 列 （ GenBank 登 录 号 NM _ 104046） 与 rs 基因序列（ GenBank 登录号 DQ 459351） 设计引物，采用 RT-PCR 的方法扩增出目的基因。目 的基因扩增片段回收纯化后与 pGEM-T Easy 载体连 接过夜，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，蓝白斑筛 选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后送至上海华大基 因进行序列测定。获得的质粒命名为 pGEM-T-4CL 和 pGEM-T-RS。 1. 2. 2 酿酒酵母表达载体的构建
精确称取 1 mg 白藜芦醇标准品，用甲醇定容于 10 mL 容量瓶，配制成浓度为 100 mg / L 的白藜芦醇 标样。分别精密吸取 100 mg / L 的标样 0，0. 25，0. 5， 1. 0，2. 0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇 匀，即获得浓度分别为 0，2. 5，5，10，20 mg / L 的标样， 制作标准曲线。
研究报告
白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达*
孙萍，郭丽琼，梁景龙，林俊芳，黄晓燕，黄佳俊
（ 华南农业大学 食品学院，广东 广州，510640）
摘 要 将克隆自拟南芥的 4cl 基因和巨峰葡萄的 rs 基因，利用降落重叠延伸 PCR 的方法，成功构建了含有 G418 抗性筛选标记的酵母表达载体 pRS42K-4CL 以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体 pRS42H-RS。 采用 LiAc / SS carrier DNA / PEG 法将含有目的基因的 2 个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株 EC1118 中，通过 PCR 及酶切鉴定等方法验证重组工程菌。以对香豆酸为底物，将获得的酿酒酵母工程菌于 YPD 液体培养基中 发酵（ 25 ℃ ，150 r / min，96 h） ，发酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱（ HPLC） 法进行检测，其结果显示发 酵产物中白藜芦醇的含量为 0. 78 mg / L。这表明，拟南芥的 4cl 基因与巨峰葡萄的 rs 基因在酿酒酵母工程菌中 成功得到了表达，并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜 芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。 关键词 白藜芦醇，酿酒酵母，组合表达，4-香豆酰辅酶 A 连接酶，白藜芦醇合酶
以质 粒 pRS42H 为 模 板，用 引 物 P1-5' TATGGATCCCAGCGACATGGAGG3' （ 下划线为 BamHⅠ位 点） 及引物 P2-5' CGCCATGGTTGTTTATGTTCGGAT3' 扩增得到启动子 TEF1p （ A） ，大小为 348bp； 用引物 P3-5' GTTATGTCACGCTTACATTCACGCC3' 及 引 物 P4-5' TCCTCGAGCGTCCCAAAACCTTC3' （ 下 划 线 为 Xho Ⅰ 位 点） 扩 增 得 到 终 止 子 CYC1t （ A） ，大 小 为 225bp。以 质 粒 pGEM-T-4CL 为 模 板，用 引 物 P5-5' GAACATAAACAACCATGGCGCCACAAGAAC3' 及 引 物 P6-5' TGTAAGCGTGACATAACTCACAATCCATTTGCTAG3'扩增得到带重叠片段的 4cl 基因。采用降 落重叠延伸 PCR 的方法［14，15］，将启动子 TEF1p（ A） 、 4cl 基因以及终止子 CYC1t（ A） 连接成一个完整的基 因表 达 框 TEF1p-4cl-CYC1t （ T4C ） ，回 收 纯 化 后 与 pGEM-T Easy 载体连接过夜，转化大肠杆菌 DH5α 感 受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定 后送至上海华大基因进行序列测定，并将该质粒命名 为 pGEM-T-T4C。
表 达 载 体 pRS42H-RS 的 构 建 方 法 与 载 体 pRS42K-4CL 的构建方法相同。启动子 TEF1p（ B） 由 引物 P1 和引物 P7-5' TCGACTGAAGCCATGGTTGTTTATGTTC3'扩增得到； 终 止 子 CYC1t （ B） 由 引 物 P3 和 引 物 P8-5' TCAAGCTTCGTCCCAAAACCTTCTC3' （ 下划线为 Hind Ⅲ位点） 扩增得到； 带重叠片段的 rs 基 因 由 引 物 P9-5' ATGGCTTCAGTCGAGGAATTTAGAAAC3' 和 引 物 P10-5' GTAAGCGTGACATAACCTTAATTTGTAACCATAG3' 以质 粒 pGEM-T-RS 为 模 板扩增得到。 1. 2. 3 酿酒酵母 EC1118 的转化及鉴定
白藜芦醇在植物体内可经由苯丙氨酸代谢途径 生成。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（ PAL） 及 4-羟基 羧化酶（ C4H） 的 作 用 下 或 酪 氨 酸 在 酪 氨 酸 解 氨 酶 （ TAL） 的作用下生成对香豆酸，生成的对香豆酸在 4香豆酰辅酶 A 连接酶（ 4CL） 的作用下生成 4-香豆酰 辅酶 A。一分子的 4-香豆酰辅酶 A 和三分子的丙二 酰辅酶 A 在白藜芦醇合酶（ RS） 的作用下生成白藜芦 醇。目前，国外的研究人员主要是将 4cl 和 rs 2 个关 键酶基因引入大肠杆菌或酵母菌中，以对香豆酸为前 体物质合成白藜芦醇，产量因基因及菌株的不同而有 所变化［6］，其 在 酵 母 工 程 菌 中 的 产 量 最 低 为 1. 45 μg / L［7］，最高为 391 mg / L［8］。国内关于白藜芦醇合
LB 培养基： 胰蛋白胨 10 g / L，酵母提取物 5 g / L， NaCl 10 g / L，琼脂粉 15 g / L（ 固体） ，121℃ 高压灭菌 20 min。抗性筛选时加入氨苄青霉素，终浓度为 80 mg / L。
YPD 培养基： 酵母提取物 10 g / L，蛋白胨 20 g / L，葡萄糖 20 g / L，琼脂粉 20 g / L（ 固体） ，121℃ 高压 灭菌 20 min。抗性筛选时加入潮霉素和 G418 硫酸
第一作 者： 硕 士 研 究 生 （ 林 俊 芳 教 授 为 通 讯 作 者，linjf @ scau. edu. cn） 。 * 国家自然科学基金项目（ No. 31272217； No. 31071837） 收稿日期： 2013 － 04 － 13，改回日期： 2013 － 07 － 04
酶（ RS） 的研究很多，rs 基因也成功在植物、酵母以及 原核生物中成功表达［9 － 12］，但将 4cl 和 rs 2 个基因同 时转入酵母中并成功合成白藜芦醇的研究尚未见报 道。
8 2013 Vol. 39 No. 8 （ Total 308）
研究报告
2 结果与分析
2. 1 4cl 基因和 rs 基因的克隆 RT-PCR 扩 增 所 得 的 拟 南 芥 4cl 基 因 大 小 为
1 686 bp，测序结果与 NCBI 上所报道的拟南芥 4cl 基 因核酸序列的一致性为 100% ； 所得的巨峰葡萄 rs 基 因大小为 1 179 bp，测序结果与 NCBI 上所报道的酿 酒葡萄 rs 基因核酸序列的一致性为 99% ，氨基酸序 列的同 源 性 为 99% 。 已 将 该 rs 基 因 登 录 至 GenBank，其登录号为 KC417318。 2. 2 酿酒酵母表达载体的构建 2. 2. 1 表达载体 pRS42K-4CL 的构建
挑取酿酒酵母工程菌株的单菌落于液体培养基 YPD 中预培养至 OD600 = 0. 2，添加 0. 1 mmol / L 对香 豆酸为底物，25 ℃ ，150 r / min，发酵 96 h。每隔 24 h 添加 0. 1 mmol / L 对香豆酸［17］，96 h 发酵后取 1 mL 发酵液用等体积的乙酸乙酯进行抽提，离心，吸取上 层有机相，抽提 2 次，合并乙酸乙酯，旋转蒸发后溶于 1 mL 甲醇，经 0. 22 μm 微孔滤膜过滤后，待测。 1. 2. 5 高效液相色谱( HPLC) 法检测白藜芦醇
启动子 TEF1p （ A） 、4cl 基因以及终止子 CYC1t （ A） 3 个片段通过降落重叠延伸 PCR 成功连接成一 个完 整 的 基 因 表 达 框 （ T4C） ，其 片 段 大 小 为 2 259 bp，前后分别带有限制性内切酶 BamHⅠ位点和 Xho Ⅰ 位 点。将 测 序 正 确 的 质 粒 pGEM-T-T4C 与 载 体 pRS42K 分别用内切酶 BamHⅠ和 Xho Ⅰ消化，过夜 连接后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒， 酶切鉴定分析重组子，结果如图 1 所示。
本研究将克隆自拟南芥的 4cl 基因和巨峰葡萄 的 rs 基因，分别构建酵母表达载体共同转入酿酒酵 母中实现白藜芦醇的生物合成，为进一步实现白藜芦 醇在酵母中的工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料和试剂 1. 1. 1 基因、菌株及质粒
4cl 基因从哥伦比亚型拟南芥（ 由华南农业大学 生命科学学院陶利珍馈赠） 中克隆，rs 基因从巨峰葡 萄中克隆； 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae） EC1118 为 Lallemand 公 司 市 售 干 酵 母； 质 粒 pRS42H 及 pRS42K 由欧洲分子生物学实验室的 Christof Taxis 教 授和 Michael Knop 教授馈赠［13］； 大肠杆菌 DH5α 由 本实验室保存。 1. 1. 2 培养基
将重组质粒 pRS42K-4CL 和 pRS42H-RS 参照 LiAc / SS carrier DNA / PEG 法［16］转化酿酒酵母 EC1118 感受态细胞，42 ℃ 热击 40 min，13 000 r / min，离 心 30 s，弃上清，加入 1 mL YPD 液体培养基，25 ℃ 摇床 培养 2 ～ 3 h，转化细胞涂布于含有 G418 和潮霉素的 培养基上，25 ℃ 恒温培养 2 ～ 3 d，初步确定能在选择 培养上生长的为拟转化子。挑取拟转化子的单菌落 进行 PCR 鉴定。 1. 2. 4 酿酒酵母工程菌的发酵及白藜芦醇的提取
将重组质粒 pGEM-T-T4C 和含有 G418 抗性基因 的载体 pRS42K 分别用限制性内切酶 BamHⅠ和 Xho Ⅰ进行双酶切，回收目的片段，在 T4 DNA 连接酶的
作用下，按摩尔数比为 3∶ 1，16℃ 连接过夜，转化大肠 杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定重组质 粒。重组质粒命名为 pRS42K-4CL。
白藜芦醇（ resveratrol） 是植物在受到生物或非生 物胁迫时，如真菌感染、紫外照射等，产生的一种能提 高植物抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素，主要 存在于各种浆果、花生以及药用植物 （ 如虎杖） 中。 白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老以及保护心血管 和调节雌激素等多种保健作用［1 － 5］，可在医药、食品、 化妆品等行业中广泛应用。在自然条件下，植物体内 的白藜芦醇含量非常低，且植物生长缓慢，白藜芦醇 的工业化生产面临着提取难，得率低，成本高等问题。 近年来，利用基因工程重组技术在微生物中高效表达 白藜芦醇成为研究热点。
2013 年第 39 卷第 8 期（ 总第 308 期） 7
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
盐，终浓度均为 200 mg / L。 1. 1. 3 酶和主要试剂
LA Taq 酶、Ex Taq 酶、T4 DNA 连接酶、各种限制 性内切酶等，购自 Takara 公司； 质粒 小 量 提 取 试 剂 盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒等，购自天根生化科 技有限公司； pGEM-T Easy 载体，购自 Promega 公司； 对香豆酸（ 纯度≧ 98% ） 购自阿拉丁试剂（ 上海） 有 限公司； 白藜芦醇标准品，购自广州齐云生物科技有 限公司； 乙腈、甲醇为色谱纯； 其他试剂均为国产分析 纯。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 4cl 基因和 rs 基因的克隆
分别提取拟南芥和巨峰葡萄叶子中的总 RNA， 根据已报道的 4cl 基 因 序 列 （ GenBank 登 录 号 NM _ 104046） 与 rs 基因序列（ GenBank 登录号 DQ 459351） 设计引物，采用 RT-PCR 的方法扩增出目的基因。目 的基因扩增片段回收纯化后与 pGEM-T Easy 载体连 接过夜，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，蓝白斑筛 选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后送至上海华大基 因进行序列测定。获得的质粒命名为 pGEM-T-4CL 和 pGEM-T-RS。 1. 2. 2 酿酒酵母表达载体的构建
精确称取 1 mg 白藜芦醇标准品，用甲醇定容于 10 mL 容量瓶，配制成浓度为 100 mg / L 的白藜芦醇 标样。分别精密吸取 100 mg / L 的标样 0，0. 25，0. 5， 1. 0，2. 0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇 匀，即获得浓度分别为 0，2. 5，5，10，20 mg / L 的标样， 制作标准曲线。
研究报告
白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达*
孙萍，郭丽琼，梁景龙，林俊芳，黄晓燕，黄佳俊
（ 华南农业大学 食品学院，广东 广州，510640）
摘 要 将克隆自拟南芥的 4cl 基因和巨峰葡萄的 rs 基因，利用降落重叠延伸 PCR 的方法，成功构建了含有 G418 抗性筛选标记的酵母表达载体 pRS42K-4CL 以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体 pRS42H-RS。 采用 LiAc / SS carrier DNA / PEG 法将含有目的基因的 2 个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株 EC1118 中，通过 PCR 及酶切鉴定等方法验证重组工程菌。以对香豆酸为底物，将获得的酿酒酵母工程菌于 YPD 液体培养基中 发酵（ 25 ℃ ，150 r / min，96 h） ，发酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱（ HPLC） 法进行检测，其结果显示发 酵产物中白藜芦醇的含量为 0. 78 mg / L。这表明，拟南芥的 4cl 基因与巨峰葡萄的 rs 基因在酿酒酵母工程菌中 成功得到了表达，并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜 芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。 关键词 白藜芦醇，酿酒酵母，组合表达，4-香豆酰辅酶 A 连接酶，白藜芦醇合酶
以质 粒 pRS42H 为 模 板，用 引 物 P1-5' TATGGATCCCAGCGACATGGAGG3' （ 下划线为 BamHⅠ位 点） 及引物 P2-5' CGCCATGGTTGTTTATGTTCGGAT3' 扩增得到启动子 TEF1p （ A） ，大小为 348bp； 用引物 P3-5' GTTATGTCACGCTTACATTCACGCC3' 及 引 物 P4-5' TCCTCGAGCGTCCCAAAACCTTC3' （ 下 划 线 为 Xho Ⅰ 位 点） 扩 增 得 到 终 止 子 CYC1t （ A） ，大 小 为 225bp。以 质 粒 pGEM-T-4CL 为 模 板，用 引 物 P5-5' GAACATAAACAACCATGGCGCCACAAGAAC3' 及 引 物 P6-5' TGTAAGCGTGACATAACTCACAATCCATTTGCTAG3'扩增得到带重叠片段的 4cl 基因。采用降 落重叠延伸 PCR 的方法［14，15］，将启动子 TEF1p（ A） 、 4cl 基因以及终止子 CYC1t（ A） 连接成一个完整的基 因表 达 框 TEF1p-4cl-CYC1t （ T4C ） ，回 收 纯 化 后 与 pGEM-T Easy 载体连接过夜，转化大肠杆菌 DH5α 感 受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定 后送至上海华大基因进行序列测定，并将该质粒命名 为 pGEM-T-T4C。
表 达 载 体 pRS42H-RS 的 构 建 方 法 与 载 体 pRS42K-4CL 的构建方法相同。启动子 TEF1p（ B） 由 引物 P1 和引物 P7-5' TCGACTGAAGCCATGGTTGTTTATGTTC3'扩增得到； 终 止 子 CYC1t （ B） 由 引 物 P3 和 引 物 P8-5' TCAAGCTTCGTCCCAAAACCTTCTC3' （ 下划线为 Hind Ⅲ位点） 扩增得到； 带重叠片段的 rs 基 因 由 引 物 P9-5' ATGGCTTCAGTCGAGGAATTTAGAAAC3' 和 引 物 P10-5' GTAAGCGTGACATAACCTTAATTTGTAACCATAG3' 以质 粒 pGEM-T-RS 为 模 板扩增得到。 1. 2. 3 酿酒酵母 EC1118 的转化及鉴定
白藜芦醇在植物体内可经由苯丙氨酸代谢途径 生成。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（ PAL） 及 4-羟基 羧化酶（ C4H） 的 作 用 下 或 酪 氨 酸 在 酪 氨 酸 解 氨 酶 （ TAL） 的作用下生成对香豆酸，生成的对香豆酸在 4香豆酰辅酶 A 连接酶（ 4CL） 的作用下生成 4-香豆酰 辅酶 A。一分子的 4-香豆酰辅酶 A 和三分子的丙二 酰辅酶 A 在白藜芦醇合酶（ RS） 的作用下生成白藜芦 醇。目前，国外的研究人员主要是将 4cl 和 rs 2 个关 键酶基因引入大肠杆菌或酵母菌中，以对香豆酸为前 体物质合成白藜芦醇，产量因基因及菌株的不同而有 所变化［6］，其 在 酵 母 工 程 菌 中 的 产 量 最 低 为 1. 45 μg / L［7］，最高为 391 mg / L［8］。国内关于白藜芦醇合
LB 培养基： 胰蛋白胨 10 g / L，酵母提取物 5 g / L， NaCl 10 g / L，琼脂粉 15 g / L（ 固体） ，121℃ 高压灭菌 20 min。抗性筛选时加入氨苄青霉素，终浓度为 80 mg / L。
YPD 培养基： 酵母提取物 10 g / L，蛋白胨 20 g / L，葡萄糖 20 g / L，琼脂粉 20 g / L（ 固体） ，121℃ 高压 灭菌 20 min。抗性筛选时加入潮霉素和 G418 硫酸
第一作 者： 硕 士 研 究 生 （ 林 俊 芳 教 授 为 通 讯 作 者，linjf @ scau. edu. cn） 。 * 国家自然科学基金项目（ No. 31272217； No. 31071837） 收稿日期： 2013 － 04 － 13，改回日期： 2013 － 07 － 04
酶（ RS） 的研究很多，rs 基因也成功在植物、酵母以及 原核生物中成功表达［9 － 12］，但将 4cl 和 rs 2 个基因同 时转入酵母中并成功合成白藜芦醇的研究尚未见报 道。
8 2013 Vol. 39 No. 8 （ Total 308）
研究报告
2 结果与分析
2. 1 4cl 基因和 rs 基因的克隆 RT-PCR 扩 增 所 得 的 拟 南 芥 4cl 基 因 大 小 为
1 686 bp，测序结果与 NCBI 上所报道的拟南芥 4cl 基 因核酸序列的一致性为 100% ； 所得的巨峰葡萄 rs 基 因大小为 1 179 bp，测序结果与 NCBI 上所报道的酿 酒葡萄 rs 基因核酸序列的一致性为 99% ，氨基酸序 列的同 源 性 为 99% 。 已 将 该 rs 基 因 登 录 至 GenBank，其登录号为 KC417318。 2. 2 酿酒酵母表达载体的构建 2. 2. 1 表达载体 pRS42K-4CL 的构建
挑取酿酒酵母工程菌株的单菌落于液体培养基 YPD 中预培养至 OD600 = 0. 2，添加 0. 1 mmol / L 对香 豆酸为底物，25 ℃ ，150 r / min，发酵 96 h。每隔 24 h 添加 0. 1 mmol / L 对香豆酸［17］，96 h 发酵后取 1 mL 发酵液用等体积的乙酸乙酯进行抽提，离心，吸取上 层有机相，抽提 2 次，合并乙酸乙酯，旋转蒸发后溶于 1 mL 甲醇，经 0. 22 μm 微孔滤膜过滤后，待测。 1. 2. 5 高效液相色谱( HPLC) 法检测白藜芦醇
启动子 TEF1p （ A） 、4cl 基因以及终止子 CYC1t （ A） 3 个片段通过降落重叠延伸 PCR 成功连接成一 个完 整 的 基 因 表 达 框 （ T4C） ，其 片 段 大 小 为 2 259 bp，前后分别带有限制性内切酶 BamHⅠ位点和 Xho Ⅰ 位 点。将 测 序 正 确 的 质 粒 pGEM-T-T4C 与 载 体 pRS42K 分别用内切酶 BamHⅠ和 Xho Ⅰ消化，过夜 连接后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，提取质粒， 酶切鉴定分析重组子，结果如图 1 所示。
本研究将克隆自拟南芥的 4cl 基因和巨峰葡萄 的 rs 基因，分别构建酵母表达载体共同转入酿酒酵 母中实现白藜芦醇的生物合成，为进一步实现白藜芦 醇在酵母中的工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料和试剂 1. 1. 1 基因、菌株及质粒
4cl 基因从哥伦比亚型拟南芥（ 由华南农业大学 生命科学学院陶利珍馈赠） 中克隆，rs 基因从巨峰葡 萄中克隆； 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae） EC1118 为 Lallemand 公 司 市 售 干 酵 母； 质 粒 pRS42H 及 pRS42K 由欧洲分子生物学实验室的 Christof Taxis 教 授和 Michael Knop 教授馈赠［13］； 大肠杆菌 DH5α 由 本实验室保存。 1. 1. 2 培养基
将重组质粒 pRS42K-4CL 和 pRS42H-RS 参照 LiAc / SS carrier DNA / PEG 法［16］转化酿酒酵母 EC1118 感受态细胞，42 ℃ 热击 40 min，13 000 r / min，离 心 30 s，弃上清，加入 1 mL YPD 液体培养基，25 ℃ 摇床 培养 2 ～ 3 h，转化细胞涂布于含有 G418 和潮霉素的 培养基上，25 ℃ 恒温培养 2 ～ 3 d，初步确定能在选择 培养上生长的为拟转化子。挑取拟转化子的单菌落 进行 PCR 鉴定。 1. 2. 4 酿酒酵母工程菌的发酵及白藜芦醇的提取