实验二微量凯氏定氮法测定总氮量说课讲解
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• 本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。
2020/7/11
三、试剂
• 1、浓硫酸
200mL
• 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
16g
K2S04与CuS04.5H20以 3：1配比研磨混合
Biblioteka Baidu
• 3、30％氢氧化钠溶液
1 000 mL
• 4、2％硼酸溶液
5 000 mL
• 5、标准盐酸溶液(约0．01 mol／L)
– 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。
2020/7/11
改 进 型 凯 氏 定 氮 仪 结 构
2020/7/11
• 特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小， 安装容易，操作简便。
– (1)水蒸汽发生器和反应室 – (2)冷凝器和通气室 – (3)排水柱
• 关键:搞清水管系统
2020/7/11
4.滴定
• 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
2020/7/11
5.计算
• 总氮量=C(V1-V2)×0.014/w × 消化液量(ml)
/ 滴定消耗用液量(ml) • c为标准盐酸溶液摩尔浓度； • V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数； • V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数 • w为样品重量(g)。 • 14为氮的相对量子质量。 • 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则， 样品中蛋白质含量(％)二总氮量×6．25
• 加样:
– 用移液管取5 mL消化液，细心地加入反应室，随后加入30％NaOH溶液5mL ，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。
• 蒸馏:
– 关闭自由夹,打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。 – 点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约2―3分钟)，开
始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少 量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶 口。 – 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 如此3～5次。最后将自由 夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。 – 待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
• ３．清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1 ～2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干 净。
•
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3蒸馏过程：
• 准备:
– 取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2％硼 酸溶液和1―2滴指示剂，溶液呈淡 紫色，用表面皿覆盖备用。
– 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指 示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。
2020/7/11
思考题
• 1、何谓消化？如何判断消化终点？ 2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？ 3、固体样品为什么要烘干？ 4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？ 5、如何证明蒸馏器洗涤干净？ 6、本实验应如何避免误差？
2020/7/11
实验二 总氮量的测定―凯氏定氮法
• 一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术 • 二 原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生
氨经硼酸吸收后用标准无机 酸滴定即可测出待测物中的总氮量 • 三 试剂：
浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物、NaOH、硼酸、盐酸 、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉 • 四 器材： 凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分 析天平、烘箱、电炉、100ml蒸馏烧瓶、小玻璃珠 • 五 操作步骤 • 六 实验报告
2020/7/11
二、原理
• 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白 质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
• 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫
酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化
剂，后者可提高硫酸沸点。 甘氨酸的消化过程可表示如下：
– 方法:一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在 100℃以下烘干。
– 在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于 105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降 至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一 次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
2020/7/11
蒸馏器的洗涤
• １． 接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(先关闭进 水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜),用酒精灯将其加热烧开。
• ２．水的自动喷出：
– 将蒸馏水由加样室加入反应室， – 将酒精灯移开片刻，
– 打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器， – 如此反复清洗3-5次。
• 6、混合指示剂(田氏指示剂) 由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙l醇溶
液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色， 碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
• 7、市售标准面粉和富强粉各2g
•
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五、操作方法
• 1.样品处理
– 原因: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g 数来表示(％)。
CH2NH2COOH+3H2SO4
2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4
(NH4)2SO4
• 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生 的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶 液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液 中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于 待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。
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三、试剂
• 1、浓硫酸
200mL
• 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
16g
K2S04与CuS04.5H20以 3：1配比研磨混合
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• 3、30％氢氧化钠溶液
1 000 mL
• 4、2％硼酸溶液
5 000 mL
• 5、标准盐酸溶液(约0．01 mol／L)
– 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。
2020/7/11
改 进 型 凯 氏 定 氮 仪 结 构
2020/7/11
• 特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小， 安装容易，操作简便。
– (1)水蒸汽发生器和反应室 – (2)冷凝器和通气室 – (3)排水柱
• 关键:搞清水管系统
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4.滴定
• 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
2020/7/11
5.计算
• 总氮量=C(V1-V2)×0.014/w × 消化液量(ml)
/ 滴定消耗用液量(ml) • c为标准盐酸溶液摩尔浓度； • V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数； • V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数 • w为样品重量(g)。 • 14为氮的相对量子质量。 • 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则， 样品中蛋白质含量(％)二总氮量×6．25
• 加样:
– 用移液管取5 mL消化液，细心地加入反应室，随后加入30％NaOH溶液5mL ，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。
• 蒸馏:
– 关闭自由夹,打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。 – 点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约2―3分钟)，开
始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少 量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶 口。 – 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 如此3～5次。最后将自由 夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。 – 待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
• ３．清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1 ～2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干 净。
•
2020/7/11
3蒸馏过程：
• 准备:
– 取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2％硼 酸溶液和1―2滴指示剂，溶液呈淡 紫色，用表面皿覆盖备用。
– 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指 示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。
2020/7/11
思考题
• 1、何谓消化？如何判断消化终点？ 2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？ 3、固体样品为什么要烘干？ 4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？ 5、如何证明蒸馏器洗涤干净？ 6、本实验应如何避免误差？
2020/7/11
实验二 总氮量的测定―凯氏定氮法
• 一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术 • 二 原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生
氨经硼酸吸收后用标准无机 酸滴定即可测出待测物中的总氮量 • 三 试剂：
浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物、NaOH、硼酸、盐酸 、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉 • 四 器材： 凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分 析天平、烘箱、电炉、100ml蒸馏烧瓶、小玻璃珠 • 五 操作步骤 • 六 实验报告
2020/7/11
二、原理
• 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白 质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
• 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫
酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化
剂，后者可提高硫酸沸点。 甘氨酸的消化过程可表示如下：
– 方法:一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在 100℃以下烘干。
– 在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于 105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降 至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一 次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
2020/7/11
蒸馏器的洗涤
• １． 接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(先关闭进 水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜),用酒精灯将其加热烧开。
• ２．水的自动喷出：
– 将蒸馏水由加样室加入反应室， – 将酒精灯移开片刻，
– 打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器， – 如此反复清洗3-5次。
• 6、混合指示剂(田氏指示剂) 由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙l醇溶
液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色， 碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
• 7、市售标准面粉和富强粉各2g
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2020/7/11
五、操作方法
• 1.样品处理
– 原因: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g 数来表示(％)。
CH2NH2COOH+3H2SO4
2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4
(NH4)2SO4
• 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生 的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶 液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液 中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于 待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。