4-3 简述原生质体融合育种和DNA重组育种的方法、原理与意义。

植物原生质体培养及细胞融合总结

◆低温处理
龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。
（在很多情况下材料不必经过专门的预处理）
（二）原生质体分离方法
1. 机械法
Klercker 于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。
其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，
1968年，纤维素酶和离析酶商品化生产后，大量进行植物原生质体的研究。
现在
果胶酶处理 → 单细胞－－纤维素酶处理 → 原生质体
分离原生质体最有效方法。
细胞壁的组成
纤维素半纤维素果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶半纤维素酶果胶酶
少量蛋白质
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有纤维素酶 C ，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，
Piwowarczyk （1978 ）改进了上述方法两液相下层：培养基，含 500mM/L 蔗糖中层：培养基，含 140mM/L 蔗糖，360mM/L 山梨醇上层：含原生质体酶液，含 300mM/L 山梨醇和100mM/L CaCl 2
现在用不同连续梯度 Ficoll （聚蔗糖）溶液，上面为酶 -原生质体混合液，经离心（ 150g ，5min ）, 不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。
缺点
原生质体易受热伤害，易破碎。
五、低密度培养
与细胞培养相似，原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。
原生质体培养的一般密度为 104-105。

植物原生质体融合技术

要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优化生物反应器，实现融合过程的自动化和连续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通常在特定的电融合装置中进行，需要在特定的电场强度和脉冲时间下进行操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等诱导原生质体融合，通过调节PEG浓度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点

微生物菌种的选育和保藏--基因重组育种、原生质体融合育种、基因工程

七、基因工程
2 基因工程的基本操作 ➢ 基本操作步骤： ➢ 目的基因与载体DNA的体外重组：使用特定的内切酶（一般为Ⅱ型内切酶）消化目的基因与载体DNA，使它们产生互补的粘性末端或平末端； ➢ 重组载体引入受体细胞：可通过转化、转染的方法； ➢ 重组受体细胞的筛选和鉴定； ➢ 工程菌”或“工程细胞”的大规模培养。
五、基因重组育种
2 原核微生物的基因重组--转化 ➢ 转化过程：以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因（抗链霉素基因），这就是转化子。
五、基因重组育种
2 原核微生物的基因重组--转化 ➢ 转染与转化： ✔转染定义：把噬菌体或其他病毒DNA(RNA)提取出来，用它以转化的方式去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或病毒后代； ✔转染和转化区别:作为转染的病毒核酸，并不是作为供体基因的功能，不发生遗传因子的交换或整合，被感染的宿主也不是形成转化子的受体菌； ✔转染特点:提纯的噬菌体DNA以转化的( 而非感染)途径进入宿主细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。
4 ➢ 准性生殖（杂交）过程：
01
Part One
五、基因重组育种
真核微生物的基因重组--有性杂交、准性杂交
五、基因重组育种
4 真核微生物的基因重组--有性杂交、准性杂交 ➢ 有性生殖、准性生殖（杂交）的比较：
六、原生质体融合育种
1 原生质体融合育种 ➢ 原生质体融合育种概念： ✔通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程； ✔原核微生物中的细菌、放线菌，真核微生物的酵母菌、霉菌，高等动植物细胞都能进行原生质体融合。
部分缺陷噬菌体的形成
五、基因重组育种

《原生质体融合育种》课件

原生质体融合育种
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合，以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移，加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术，将酶活性提高的基因导入微生物中，提高微生物产酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离，实现基因在不同物种间的转移，从而创造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状集中到一个新品种中，实现高效基因导入。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中，提高动物的抗病能力，减少疾病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术，将高产菌株进行杂交育种，获得具有优良性状的高产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微生物中，提高微生物的抗菌或抗药性，用于医药、农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传稳定性，因此新品种的遗传稳定性较差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题，需要进行严格的伦理审查和法规限制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合的技术水平，提高融合效率和遗传稳定性。
拓展应用领域

第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合

4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化

类脂质分子发生扰动和重排导致细胞桥的形成细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等
2、原生质体融合的方法

物理法、化学法及生物法。
原理增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法

在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。

原理与过程

灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。
特点

研究最早的促融剂。毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法

包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻

细菌原生质体育种技术及其应用进展

四、实验过程
3、原生质体融合
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入
0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻
摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。
四、实验过程
（二）原生质体融合育种流程：
选择亲本
制备原生质体原生质体再生
遗传标记、选择性培养基
化学融合、电融合
促融合
高渗
破壁
融合子筛选
反复
检出融合子
四、实验过程
（三）实验过程
1、选择亲本
选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
四、实验过程
2、原生质体的制备
的重要基因重组技术。1976年FODORK等采用聚乙二醇（PEG）、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌原生质体
的融合，SCHAEFFEP等报道了用PEG诱导枯草芽孢
杆菌的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发
表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技
术发展的里程碑，经过30余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。
1、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合； 2、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会； 3、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状； 4、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种； 5、能够用于遗传分析等基础理论研究等。
七、意义及展望
细菌原生质体融合育种技术不但可以
改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。

植物原生质体融合

植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。

它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。

采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。

酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。

植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。

每克材料用酶液10～30ml不等。

由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。

例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。

酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。

去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。

如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。

对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。

酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。

对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。

酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。

但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。

酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。

原生质体融合育种

原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。

其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。

在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。

因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。

关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。

当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。

原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。

[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。

[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。

1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。

常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。

其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。

[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。

去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。

[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。

丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。

[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。

原生质体融合育种

影响原生质体再生的因素（略）
菌体生理状态稳定剂酶浓度与酶作用时间再生培养基的组成原生质体的密度
……
三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
✓ P在EPPEGGE介G法导法融原合原时生，生通质常质需体要体的一定的融浓度融合的C合图a2+和图示Mg示2+，能更有效地促进融合。
异核体、杂合体以及重组体都能在选择培养基上生长。
单倍体化
异核体
单倍体
繁殖传代
杂合体
单倍体
重组体常用的鉴别方法
菌体或孢子形态和大小的比较； DNA含量的测定比较；同工酶电泳谱带的比较；酶活性的测定；代谢产物组成和产量的分析比较与测定；对营养物质的利用以及超微结构的变化等。
第4节基因组改组育种
➢ FDA本身不发荧光，被细胞吸收脂解后产生具有荧光的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（吸收-代谢-呈色）
②酚藏花红染色法
➢活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成红色，无活性的死细胞不能吸收染料呈白色;（吸收-呈色）
③伊文思蓝染色法
➢ 活性原生质体不吸附染料为无色，死的无活性细胞吸附染料呈蓝色。（不吸收-呈色）
利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分离筛选融合体。
不利用木糖，抗放线菌酮
能利用木糖，对放线菌酮敏感
含有木糖和放线菌酮的选择培养基上检出融合体
6．融合体的其他选择方法
①利用某些微生物对昆虫的毒力进行选择（略）； ②通过形态差异进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌株具
有可供肉眼直接观察的形态学差异； ③通过生化测定指标选择融合体。通常测定的生化项目有DNA含量、

原生质体融合育种

物理融合剂：电场、激光
（二）原生质体融合的影响因素１、融合剂电场融合的优点：适于动植物、微生物细胞；融合频率高可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生复原：再生培养基细胞壁重建形成菌落 P239 图9.8
第五节酵母菌原生质体融合育种一、酵母细胞壁结构和遗传标记菌龄对原生质体形成影响大亲本灭火的方法：紫外线
热药物
第五节酵母菌原生质体融合育种一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节霉菌原生质体融合育种二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长（3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种三、原生质体转化育种何种形式DNA转化率高？质粒
第一节微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种脂质体转移原生质体转染等
第二节微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。

植物原生质体融合的方法

植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。

下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。

2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。

3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。

二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。

2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。

3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。

总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。

第二节原生质体融合育种

第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。

原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。

已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。

受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。

另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。

重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。

遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。

原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。

可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。

例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。

4原生质体培养和融合

细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。因为细胞壁不仅具有保护功能，还参
与细胞的生长和分化等生命活动。
但是：原生质体必须再生出细胞壁才能
继续发育。
二、原生质体分离及培养
（一）分离方法 1. 机械法：利刃机械切割 2. 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
2.Enzymatic isolation
2.1 材料 •获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。
1-2、共培养法
将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合
前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质
2、液体浅层培养
用培养基离心
用培养基悬浮
3、固、液培养
培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。
•叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂，因此，常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
2.2 酶的种类和浓度
纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase）
2、成就
1972年 Carlson
建立第一株烟草体细胞杂种。
1975年柑桔原生质体培养成功；
现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；
番茄+马铃薯
3、融合方法
自发融合 (Spontaneous fusion)
诱发融合
(induced fusion) 物理和化学方法

原生质体融合育种

原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。

其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。

在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。

因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。

关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。

当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。

原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。

[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。

[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。

1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。

常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。

其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。

[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。

去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。

[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。

丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。

[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。

植物细胞杂交技术在育种中的应用研究

植物细胞杂交技术在育种中的应用研究随着科学技术的不断发展，人类对于植物育种的需求也在逐步增加。

植物细胞杂交技术是一种常用的育种方法，在选育新品种、改良原有品种方面具有重要的意义。

本文将探讨植物细胞杂交技术的原理、方法、应用及发展趋势等方面。

一、植物细胞杂交技术的原理植物细胞杂交技术是指利用细胞质融合产生的杂交细胞，进行育种的方法。

植物细胞中含有两种基因，核基因和线粒体基因。

细胞质融合是指将两个构成不同基因组的单细胞体融合成一个细胞体后，随着时间的推移，两者逐渐合成一种新的细胞膜，使得两者彼此融合，使得交互作用更加紧密，从而形成完整的细胞质基因体系。

二、植物细胞杂交技术的方法植物细胞杂交技术有多种方法，包括原生质体融合、植物细胞原代培养、亲本细胞混合等。

下面将着重介绍两种常用的方法。

1. 原生质体融合法：原生质体融合法是将两个不同物种的植物细胞中的原生质体与细胞核分离出来，往往通过电融操作或化学方法等方式来使得其融合，并形成一个新的细胞体，此时它们的DNA、RNA、蛋白质以及其他物质也会在此进行相互作用，最终形成新的杂种。

该方法操作简单而快捷，但其效率并不高。

2. 原代细胞组培法：原代细胞培养法是指将两个不同物种的植物杂交细胞原代培养在同一个培养液内，通过培养液不断注入和改变培养液中的成分，使其分离生长并进行杂交。

此法的效率比原生质体融合法表现得更好，但操作难度较大，需要有一定的细胞培养基础知识。

三、植物细胞杂交技术在植物育种中的应用植物细胞杂交技术可大大亢进植物育种的效率，加快新品种的推广和广泛使用。

在实践生产中，如果要提高植物的品种改良效果和遗传育种效能，植物细胞杂交技术会被广泛应用于种类的生产和科研领域。

例如：1. 增强植物抗逆性：利用植物细胞杂交技术，可以将抗逆性较强的拟南芥与容易育成的食肉植物捕虫腺细胞原代培养，形成新的杂交细胞，从而提高植物的抗逆性。

2. 提高植物产量：将产量及质量好的水稻与高产的小麦进行细胞融合可大大提高其产量。

原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用

原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用摘要:原生质体融合技术是微生物遗传育种上的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在菌种选育中具有广阔的应用前景。

本文从原生质体的制备及其影响因素、原生质体融合的促融方法、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应用等方面进行了综述以及微生物原生质体融合技术的发展前景与展望。

关键词: 原生质体融合; 菌种选育; 生物技术; 应用发展前景与展望原生质体融合育种(proloplas} Iusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。

通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。

1960年法国的B ars研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时口本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。

1974年匈牙利的Fereczy采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creolrichum carol irlrmv)营养缺陷型突变株原生质体的融合;随后人们相继用NaC1KCl和Ca(N03)2等作为诱变剂进行融合，但融合率比较低;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题，使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量的报告，从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。

从此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现属间、门间，甚至跨界融合。

1原生质体融合技术简介原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍---抢田胞壁，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。

原生质体融合技术简介

常用的融合子筛选方法有两种：直接法,间接法和钝化选择法
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(1)直接法原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体，而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延迟而基因已重组的融合体。
(2)间接法把融合产物分离到CM上，使原生质体再生，融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人力和物力，而且得到的重组体不大稳定。
有人指出，先用紫外线照时原生质体，再进行融合可以大
大增加融合频率
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另外，利用物理因子也可以促进细胞融合，主要是电融合技术。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了化学融合(指用PEG融合)的随机过程。同时．其融合频率高，操作简便、快速，对细胞损伤较小，并可以在显微镜下进行。
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一原生质体融合
原理：两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。
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仅仅将原生质体等量地混合在一起．融合频率仍然很低，只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)，融合频率才会提高，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。
在原生质体融合过程中，除了要加入PEG外，还要加入钙镁等阳离子，它们对融合也有促进作用。在有钙离子存在的条件下融合时pH值为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为PH能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。

微生物原生质体融合育种

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2、原生质体制备
原生质体的分离
收集
纯化
活性鉴定
保存
制备流程
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制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类( 如过氧化物酶、核糖核酸酶等) ，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集，难于原生质体化；而且，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率。
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改良菌种遗传物性
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质粒转移
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提高产量或质量，合成新物质
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优化菌种发酵物性
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原生质体与细胞核融合
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进行遗传分析
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微生物原生质体融合育种
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姓名：付凤根
一、概述
原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。原生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。

第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合

间形成细胞质通道（37℃下
1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为
H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细胞核的位置。
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原生质体融合到一起的可能。
特点
融合率高、重复性与可控制性强。装置精巧、方便简单。可在显微镜下观察或录像融合过程。可能会造成不可恢复的细胞损伤。
(2)生物法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA 与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。

14.7原生质体融合的意义和局限性

原生质体融合的意义和局限性
一、原生质体融合的意义
1、克服远缘杂交不亲合性
为遗传物质的广泛重组开辟了新途径(如野生种的优良性状加以利用等）。

白菜
甘蓝白菜-甘蓝
同学们设计一下白菜-甘蓝培育过程？
2、可缩短育种年限
不对称融合
通过物理或化学方
法，有选择的灭活
细胞核或细胞质的
遗传物质。

3、利用细胞融合技术转移细胞器
如叶绿体、线粒体及目的基因等可获得细胞质杂种。

二、体细胞杂交技术的局限性
1、体细胞杂交可以克服部分远缘杂交的不亲合性，但尚不能从根本上解决此问题，仅限于少数种。

2、体细胞杂交还局限于草本植物，主要原生质体培养技术的限制。

3、难以控制供体和受体基因组有丝分裂和减数分裂中的重组行为。

4、两亲本融合时，由于全部遗传物质进行了合并，各种基因都在其中，选择符合需要的个体难度较大。

思考题
1、简述原生质体融合的意义。

2、原生质体融合目前还有哪些技术难题？
Thank You!。

4-3 简述原生质体融合育种和DNA重组育种的方法、原理与意义。

植物原生质体培养及细胞融合总结

植物原生质体融合技术

微生物菌种的选育和保藏--基因重组育种、原生质体融合育种、基因工程

《原生质体融合育种》课件

第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合

细菌原生质体育种技术及其应用进展

植物原生质体融合

原生质体融合育种

原生质体融合育种

原生质体融合育种

植物原生质体融合的方法

第二节原生质体融合育种

4原生质体培养和融合

原生质体融合育种

植物细胞杂交技术在育种中的应用研究

原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用

原生质体融合技术简介

微生物原生质体融合育种

第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合

14.7原生质体融合的意义和局限性

第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合