微生物原生质体融合2
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻
利用原生质体融合技术选育微生物菌种_谭周进
文章编号:100028551(2005)012075205综 述利用原生质体融合技术选育微生物菌种谭周进1 杨海君2 林 曙3 吴 铁3(11湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙 410128;21湖南农业大学植物保护学院,湖南长沙 410128;31湖南农业大学动物科学院,湖南长沙 410128)摘 要:对原生质体融合技术的遗传标记筛选、原生质体的制备与再生、原生质体融合等的方法,以及原生质体融合技术在提高抗生素生产效价、酵母菌工程菌株的构建、多功能菌株的选育以及污水处理工程菌的构建等方面的研究情况进行了综述。
就原生质体融合技术在微生物育种技术上的应用前景进行了分析。
关键词:原生质体融合;菌种选育;生物技术PR OTOP LAST FU SION TECHN OLOG Y AN D MICR OBIA L BREE DINGT AN Zhou 2jin 1 Y ANG Hai 2jun 2 XI AO Qi 2ming 2 LI N Shu 3 W U T ie3(11College o f Bio 2safety Science and Technology ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;2.College o f Plant Protection ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;31College o f Animal Science ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128)Abstract :Researches on selecting of genetic marks ,preparation and regeneration of protoplast ,protoplast fusion ,and the application of protoplast fusion technique in microbial breeding were reviewed.The antibiotics strain im provement ,construction of yeast engineer strain ,breeding of multi 2functional strain and construction of engineer strain to coping with waste water were als o included.The application of protoplast fusion technology in microbial breeding was analysed.K ey w ords :protoplast fusion ;strain breeding ;biotechnology收稿日期:2003211209作者简介:谭周进(1969-),男,博士,副教授,主要研究方向为微生物生态学与发酵工程。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
细菌原生质体融合步骤
细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。
1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。
由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。
由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、基因重组频率高，重组类型多。
原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。
原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。
聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。
在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
原生质体融合名词解释微生物学
原生质体融合名词解释微生物学嘿，咱今儿个就来说说原生质体融合！你知道啥是原生质体融合不？这就好比是两个不同的“小世界”突然碰撞到了一块儿，然后产生了奇
妙的变化！
想象一下啊，微生物的世界里，有两个小小的家伙，它们就像是两
个独特的“小宇宙”。
一个带着自己的特点，另一个也有着别样的本领。
然后呢，通过原生质体融合，它们的“边界”消失了，它们的特质融合
到了一起！这难道不神奇吗？比如说，一个微生物有着超强的适应能力，另一个呢，有着特别厉害的代谢能力，这一融合，哇塞，那岂不
是得到了一个更牛的“超级微生物”！
咱再打个比方，这原生质体融合就像是搭积木，不同的积木块代表
着不同的微生物特性，把它们拼到一起，就组成了一个全新的、更有
意思的结构！这不就是在创造新的可能嘛！
在微生物学里，原生质体融合可不是随便玩玩的哦！科研人员们就
像是神奇的“魔法师”，他们通过各种手段，让这些微生物乖乖地进行
融合。
这可不是件容易的事儿啊，但他们就是能做到！
“哎呀，那这原生质体融合到底有啥用啊？”你可能会这么问。
嘿，
用处可大了去了！它可以让我们获得具有新特性的微生物，这些新特
性说不定就能解决好多大问题呢！比如说，能让微生物更好地生产我
们需要的东西，或者让它们更有效地处理一些污染物。
总之啊，原生质体融合就是微生物学里一个超级有趣、超级重要的概念！它就像是打开了一扇通往新世界的大门，让我们看到了更多的可能性！我觉得这真的是太酷啦！你难道不这么认为吗？。
原生质体融合微生物名词解释
原生质体融合微生物名词解释嘿，朋友们！今天咱来聊聊原生质体融合微生物。
这玩意儿可神奇啦！就好像两个小伙伴手牵手一起玩耍，然后变成了一个全新的厉害角色。
你想想看啊，微生物世界那也是丰富多彩得很呢！原生质体融合呢，就是让不同的微生物把它们最精华的部分拿出来，然后融合在一起。
这就好比是一场微生物界的大聚会，大家把自己的优点都带来，凑在一起，创造出一个更强大、更特别的存在。
比如说，有两种微生物，一种特别能分解某种物质，另一种呢，生命力超级顽强。
那通过原生质体融合，哇塞，新产生的微生物不就既有超强的分解能力，又有顽强的生命力了嘛！这多厉害呀！这就好像一个武林高手，既有绝世神功，又有金刚不坏之身。
原生质体融合可不是随随便便就能成功的哟！这得经过一系列精细的操作和巧妙的设计呢。
就跟盖房子一样，得先设计好图纸，然后一砖一瓦地认真搭建。
科研人员们就得小心翼翼地处理这些微生物，让它们乖乖地融合在一起。
而且哦，这原生质体融合之后产生的新微生物，那可是有着无限的可能性呢！它们可能会有全新的特性和功能，给我们的生活带来意想不到的惊喜。
说不定哪天就会出现一种能快速降解垃圾的超级微生物，让我们的环境变得干干净净；或者是一种能生产出神奇药物的微生物，让人们的健康更有保障。
这难道不令人兴奋吗？想想看，小小的微生物，通过这样神奇的技术，能变得如此强大和有用。
这就好像是一个魔法，能把普通的东西变得超级厉害。
咱们生活中的很多东西都可能跟原生质体融合微生物有关系呢。
食品、药品、环保等等领域，都可能有它们的身影。
它们就像是一群默默奉献的小英雄，在我们看不到的地方发挥着巨大的作用。
所以说呀，原生质体融合微生物真的是太有趣、太重要啦！我们可得好好了解了解它们，说不定哪天我们也能参与到这个神奇的领域中呢！让我们一起期待这些微生物给我们带来更多的惊喜吧！。
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
原生质体融合技术简介
一般地说，原生质体的再生率常常只有百分之几 到百分之几十，各的甚至可达100％。如果原生质 体不能恢复成原来菌的正常状态，那么微生物的 原生质体在遗传操纵工作方面的应用将是不可能 的。
4 原生质体的融合
仅仅将原生质体等量地混合在 一起．融合频率仍然很低， 只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)，融合频率才会提高 ，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。
原生质体制备
原生质体再生及再生频率计算
原生质体的融合
异核体检出
重组体检出和鉴定
重组体的形态，生理生化和遗传分析
1 标记菌株的筛选
用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以 便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为 标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态 作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根 据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是 为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因 的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行 原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会 影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标 记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷 性菌株
两个具有丌同基因型的细胞采用适宜的水解酶剥离细胞壁后在融合剂作用下两原生质体接触融合成为异核体经过繁殖复制迚一步核融合形成杂合二倍体再经过染色体交换产生重组体达到基因重组的目的最后对重组体迚行生产性能生理生化和遗传特性分析由于原生质体没有细胞壁的障碍而且在原生质体融合时加入融合促迚剂peg所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法
6 实用性菌株的筛选
微生物原生质融合是一种新的基因重组 技术，它具有定向育种的含义。但是， 融合后所产生的融合子类型仍然是各种 各样的。性能不同，产量不同的情况仍 然存在，因此必要的人工筛选仍然很重 要 ，主要是遗传稳定性等的实验。
第六章 原生质体融合
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原ห้องสมุดไป่ตู้质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
微生物原生质体融合技术
•1957年 年 1957年，Eddy和Williumson等首次用蜗牛酶酶 年 等首次用蜗牛酶酶 和 等首次用蜗牛酶 解制备了酵母菌的原生质体
•60年代 年代
60年代捷克的 年代捷克的Brno和西班牙的 和西班牙的Salmanca两个研究中心对原 年代捷克的 和西班牙的 两个研究中心对 质体技术做了大量基础性工作 前者主要应用原生质体研 工作， 生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应用原生质体研 酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 生活史与细胞分裂 究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。 丝状真菌细胞壁的溶菌酶 效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。
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2 原生质体的融合
微生物原生质体诱导融合方法主要有
电融合 基于微流控芯片 的细胞融合技术
PEG 结合高 ＋ Ca2＋诱 导法
激光诱导融合 高通量细胞融 合芯片
Logo PEG结合高 2＋诱导法 结合高Ca ＋ 结合高
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对 是一种多聚化合物， 聚乙二醇 是一种多聚化合物 PEG分子质量的要求不尽相同。亲本原生质体制备好后， 分子质量的要求不尽相同。 分子质量的要求不尽相同 亲本原生质体制备好后， 即可进行融合。 即可进行融合。
融合（ 融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等） 、离心沉淀、电脉冲等） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 株的筛选
实用性菌 实用性菌
11
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二、原生质体融合技术的步骤与方法
融合重组体筛选
3
主要步骤
1
双亲本原生质 体制备和再生,
原生质体融合技术概述
3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点不应用
• 灭活机制 • 目前对灭活原生质体的融合机制还丌很清楚。 • 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用丌同的生化药 剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂亝细胞， 他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原 生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗 氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原 生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后迚行 融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实 验都支持了Wright 的损伤互补原则。
5、原生质体融合技术应用不展望
• 5.1目前的原生质体融合技术的的应用 具体包括： １）提高产量或质量，合成新物质，如提高抗生素的合成； ２）改良菌种的遗传特性，如酵母菌属间原生质体融合构建 高温酵母菌株和L-异亮氨酸高产菌的原生质体融合育种； ３）优化菌种的发酵特性，如酒精的酿造中的应用； ４）质粒转移； ５）原生质体不细胞核融合； ６）迚行遗传分析
酶解温度对原生质体制备的影响
• 丌同的酶具有各自丌同的最适温度，同时还要注意菌株生 长的最适温度，以避免因温度丌当而导致原生质体活性降 低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对 水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内不溶菌酶的浓度成正比。当 浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高， 但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧 化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必 然会严重地影响原生质体的活性； • 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生 时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再 生率。
原生质体融合(实验报告)
酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。
通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。
通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。
应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
原生质体制备与融合
Thanks!
• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会 因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重 要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的 山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法： 短时间强电场作用， 质膜发生可逆性电击 穿，促使原生质体融 合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法： 让原生质体先紧密 贴在一起，后用激 光对接触处照射， 使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁 不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低 。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则 是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随 酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
融合子的筛选
原核生物的基因重组(2)
基因工程的操作过程
• 基因工程的操作过程主要由以下步骤组 成：①载体和目的基因的分离；②载体 和目的基因的切断；③载体和目的基因 的重组；④重组DNA的转化和扩增；⑤ 重组DNA的筛选和鉴定。
基因工程三大理论
• DNA结构和中心法则的发现 • 质粒的发现 • 限制性内切酶的发现
基因工程三大技术
“小菌落”（呼吸缺陷型菌落）：
酵母菌由于线粒体DNA严重缺损或大部分丢失，缺失 细胞色素a、b及细胞色素c氧化酶，即使在通气条件下， 细胞生长也很缓慢，在葡萄糖培养基上只能形成小菌落。
小菌落突变株的三种类型：
野生型mtDNA ：(ρ +) ； 中性小菌落(neutral petite) (ρ 0) ： mtDNA全部丧失 抑制性小菌落(suppressive petite) (ρ -)： mtDNA部分缺失突变 分离型小菌落(segregational petite)： 染色体基因突变
3. 有性生殖与准性生殖的比较
比较项目
参与接合的亲本细胞 独立生活的异核体阶 段 接合后双倍体的细胞 形态 双倍体变为单倍体的 途径 接合发生的几率
准性生殖
形态相同的体细胞 有 与单倍体基本相同 通过有丝分裂 偶然发生，几率低
有性生殖
形态或生理上有分化 的性细胞 无 与单倍体明显不同 通过减数分裂 正常出现，几率低
2.酵母菌的接合型遗传
单倍体可以是α或a两种接合型的其中之一，一个单倍 体酵母细胞是α型还是a型是由其本身的遗传特性所决定的 ，是一种稳定的遗传特征。 一种接合型的单倍体细胞有时会发生转变，即由α型 变成a型或再回到α型 。
3. 酿酒酵母的有性杂交育种程序：
两亲本菌株的选择 单倍体细胞的分离与验证 单倍体细胞遗传标记的制作 杂交 杂合子的检出 优良性状个体的筛选与性能测试
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1. 利用. 利用抗药性选择融合体 3. 用灭活原生质体检出融合体
4. 利用荧光染色法选择融合体
5. 双亲对碳源利用不同而检出融合体 6. 融合体的其他选择方法
五、融合重组体检出与遗传特性分析
(一) 重组体的检出和鉴别的方法
1. 直接法
(二) 融合率
(三) DNA含量及孢子形态测定
重组体的进一步鉴定
1. DNA含量测定 2. 单倍化 3. 有关酶活性及孢子体积测定
4. 分子生物学方法
六、原生质体融合的应用
1. 提高产量或质量，合成新物质
2. 改良菌种遗传特性
3. 优化菌种发酵特性
4. 质粒转移
5. 原生质体与细胞核融合
(二) 菌体培养及预处理
(三) 原生质体制备
(四) 原生质体再生
(五) 原生质体融合与再生 (六) 融合体的检出
第三节 酵母菌原生质体融合育种
一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记
单细胞真核微生物
二、酵母菌原生质体融合育种技术
(一) 出发亲本菌株的筛选及单倍体分离
(二) 酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液
(一) 原生质体融合过程
霉菌：两亲株原生质体混合于高渗稳定液中在PEG的 诱导下，两个或两个以上凝聚成团相邻原生质体紧密 接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失细胞质融合， 形成一个异核体细胞异核体的细胞在繁殖过程中发生 核的融合，形成杂合二倍体通过染色体交换，产生各 种融合子(fusant)。 (二) 原生质体融合的影响因素 1. 融合剂 化学融合剂：PEG，分子量4000～6000 物理融合剂：电场和激光 2. 温度 3. 亲株的亲和力和原生质体的活性 4. 无机离子 5. 其他条件
(二) 融合体的检出与分离
原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，
即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融 合，形成异核体 。两者均可以在选择培养基上生长， 一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型， 有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的 融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然 分离和选择，才能加以确定。
6. 进行遗传分析
第二节
一、概述 1. 细菌类型和细胞壁特点
细菌原生质体融合育种
二、细菌原生质体融合育种一般程序
三、细菌原生质体融合育种技术
(一) 培养基与溶液
1. 常用培养基 2. 高渗溶液 1. 提高细菌原生质体制备率和再生率的方法 (1) 预处理：EDTA、表面活性剂 (2) 溶菌酶 (3) 细菌生理状态 (4) 培养基组成与培养条件
第十二章 工业微生物原生质体融合育种
与常规杂交相比，原生质体融合具有以下优势：
1. 大幅度提高亲本之间重组频率（10-1） 2. 扩大重组的亲本范围（远缘间产生融合
子）
3. 原生质体融合时亲本整套染色体参与交
换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双 亲本优良性状的机会更大。
三、原生质体融合
第五节 工业微生物基因组改组育种
(三) 原生质体制备：蜗牛酶
(四) 原生质体再生
(五) 酵母菌原生质体融合
(六) 融合重组体鉴定与遗传分析
二、培养基及溶液 三、霉菌原生质体融合分关键步骤
(一) 霉菌原生质体制备：多种水解酶
(二) 原生质体再生
(三) 原生质体融合和再生
(四) 融合重组体分析与鉴定
(二) 细菌原生质体融合育种
2. 建立最佳融合体系
3. 重组子分离模型
第二节 放线菌原生质体融合育种
一、放线菌细胞壁组成、结构及水解
(一) 细胞壁组成和结构：类似于G＋菌 (二) 细胞壁水解
1. 水解酶
2. 酶解环境条件
二、放线菌原生质体融合育种技术
(一) 培养基与溶液