各种印迹法的详细介绍

缓冲液中浸泡5-10min
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。
可在两块海绵之间垫上少许普
通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流 或电压太高。转膜过程注意降
温
半干转
半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲 液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶 中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿 转相比，这种方法又快（15-45 分钟）又好 。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系 统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然 而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时 间转移。
混合均匀，动作轻缓
条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微
拔梳子要迅速，清洗加样孔要小 心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带 导致宽窄不一，纯化样品，调整
笑”条带？
盐浓度
胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装
臵是否合适
转膜及抗体检测
可将凝胶在转膜之前放到转膜
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干， 铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝 胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过 1V/cm2胶面积。
样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细 胞脱落）。 ⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶ 100℃，1min。 ⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团 块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在 14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物 但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶 液粘滞度，便于上样。 ⑹ 待样品恢复到室温后上样。
背景太高
原因
1. 1. 2. 3. 4.
5.
膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
2.
对 策
3.
4.
转膜前用转膜缓冲液将膜 完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
3．组织：
⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml 裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电 动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于 1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高， 对蛋白的吸附能力要远远大于NC膜,非常适合于低分子量 蛋白的检测，小分子更不容易渗透下去，截留率高，用之 前需在甲醇溶液中浸泡10min。
转膜-转膜方法的选取
常用的有湿转和半干转 湿转：湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液 槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体 积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双 向电泳中常规使用的大胶比较困难。
半干转的电流大小是按照面积来算的，时间 是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流 是恒定的，时间也是根据分子量而定。
两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝 胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍 转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区） 。小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分 子量（100KD 以上）建议湿转
SDS-PAGE 分离胶配方
SDS-PAGE 浓缩胶配方
电泳
上层浓缩胶的电泳电压要低 于分离胶的电泳电压，使样 品更好的进入凝胶。 电泳时，应采用恒压的模 式，这样蛋白质才可以保证 恒定的电泳迁移率。 一般采用恒压浓缩胶80V， 30min分离胶110V 时间视所 要检测的蛋白分子量及胶浓 度而定。
梯度胶
有专门的梯度胶制胶器，原理是根据不同的 推进速度而将两种不同浓度的胶加以混合而 成
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马晓伟
膜的选择
转膜-膜的选择
☞ 硝酸纤维素膜（NC膜）
价格便宜，简单快速封闭与非特异性抗体结，通常有 0.45µm和0.2µm两种规格的NC膜，大于20kD的蛋白可用 0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用 0.45µm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
☞ 聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）
概述
• 生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及 分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把 凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化膜上。
• 蛋白质分析中应用的Western杂交方法与DNA分析应用中的 Southern杂交法RNA分析中的Northern杂交法相似，均是 把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体上，并均 以针对特定氨基酸或核苷酸序列所制备的特异性样品作为 探针检测其相同或相似序列。
1. 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据抗 体效价选择合适的抗体浓度，将一抗溶液与滤膜温育。室 温6小时左右，4℃过夜
2. 倒掉一抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min
3. 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温2小时 4. 倒掉二抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min,即可 准备显影
2．培养的细胞（定量）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有 可能使细胞脱落）。 ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min。 ⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后按比例加入 loading-Buffer（含DTT ）,100 ℃ ，10min。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于 1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
原理：
☞ SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子
间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水 部分相结合,破坏其折叠结构 ☞ SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平 均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身 的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白 质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电 荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离 出的条带带也为蛋白质的亚基
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
• 将在暗室中将显色剂A,B 溶液按1：1混合，后均匀涂 抹在膜上结合有二抗的地方即可催化底物发出荧光 • 将胶片贴在膜的发光区上，根据荧光强弱选择合适的 曝光时间 • 曝光结束后将胶片放入显影液中至出现条带后再放入 定影液中
转膜：膜的选择，转膜方法取舍 样品处理 Western blotting 常见问题分析及其应用
转膜操作流程
转膜
转膜电流不予太大， 否则容易使膜和胶 烧坏，仪器最大电 流为400mA 转膜时间根据目的 蛋白的分子量而定， 分子量越大，转膜
时间越长
关于转膜的注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极； 2.转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4 ℃ 冰箱； 4.滤纸不要大过膜，防止短路； 5.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡 存在，否则会导致转膜不完全； 6.注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上的 蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉； 7.在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有 非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行 转膜。
转膜后检测
丽春红染色
丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽
春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带，丽春 红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TBS-T溶液洗去
封闭
• 脱脂奶粉（5％） • BSA（牛血清白蛋白） • Western Blotting 膜封闭液
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电
泳
转膜 封闭 一抗孵育
二抗孵育 底物显色
使用的仪器
聚丙Fra Baidu bibliotek酰胺凝胶电泳
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳
迁移率主要依据其分子量和电荷的差异及形状等因素
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
迁移率主要依赖于蛋白质大小
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1) 洗转印膜：室温用TBS-T漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜
上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床 震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
一抗、二抗孵育
印迹法（Blotting）技术简介
李娟 马晓伟
oct18,2010
定义：
印迹法（Blotting）
是指将样品转移到固相载体上，然后利用相应的探测反 应来检测样品的一种方法。
•Southern blotting 1975年，Edward M. Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 •Northern blotting 1979年，McMaster和Carmichael对RNA进行印迹分析，发明 Northern印迹技术 •Western blotting 1979年，George Stark对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而 发明western印迹技术
数据处理及结果分析
1. Photoshop 软件
2. Image J 软件 3. Excel 软件 4. Graphpad prism 软件
Western bloting 的应用
• 生物学领域：各种刺激下细胞某种蛋白的表达情 况、粘放菌5519I型菌毛鉴定 • 医学领域：骨折的愈合、肿瘤发生机制、糖尿病 大鼠角膜上皮细胞HIF-1α蛋白表达量及组织工程 骨修复骨缺损的机制等病理生理学研究主要采用 免疫组化的方法 • 其它
western显色的方法主要有以下几种
i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色， 体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表 文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试 剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇 到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Southern Blotting
DNA提取 琼脂糖电泳 （变性探针） 洗膜 印迹转移 预杂交 放射自显影或显色 杂交
Northern Blotting
RNA提取 琼脂糖电泳 杂交（变性探针） 洗膜 印迹转移 预杂交 放射自显影或显色
Western Blotting基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至 膜上，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blotting常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶板洗刷干净
胶不平？ 凝胶漏液？
加入APS和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量