B6-Co小鼠Ankrd55和Ddx4突变候选基因克隆及测序

１ 材 料wenku.baidu.com与 方 法
１１ 实 验材 料 ．
１１１ 实验 动物 ．． 初生 Ｂ ６正 常 小 鼠、初 生 眼睑 开
【 作者简介】 瑶（９ ８）女， 李 １ ８．， 硕士研究生， 专业方向： 疾病
动物模型 。Ｅ ｍａｌｌ３ ２ ３ ２ ６ ． ｍ — ｉ ｙ ３ ２ ３ ＠１ ３ｃ ： ｏ 【 通讯作者】 义祥（９ ６）男， 邵 １５ 一， 教授， 博士， 究方 向： 研 疾病动
方法 以小鼠Ａ ｋ ５ 和 Ｄ ｘ 基 因的ｍＲ Ａ序列设计 引物，以ｍ Ｎ ｎｒ ５ ｄ ｄ４ Ｎ Ｒ Ａ为模板 ，采用 Ｒ ．Ｃ ＴＰ Ｒ和 Ｐ Ｒ技 术分段 进行 目的基 因扩增 ，将 目的 片段 连接 在 Ｔ载体 上 ，转化 至感 受态 细胞 ，筛选 阳性克 Ｃ
隆 ，提 取质 粒 Ｄ ＮＡ分 子 ，电泳检 测 ，ＦｏＥ酶 切释放 目的 片段 ，测序 、分析 、比对 。 结果 ｃＲ Ｄ ｘ ｄ４
协 调 细 胞 增 殖 过 程 、细 胞 形 态 的改 变 、迁 移 和 细
白 内５ 。其 主 要 表现 为角 膜 混浊 ，最 终 导致 视 觉 章【
功 能 下 降 。导致 角 膜病 的 因素很 多 ， 主要 有感 染 因 素 和 遗 传 因 素 。有 研 究 表 明 即使 是感 染 因素 导 致 ， 也 与遗传 因素密切相 关， 因而研 究角膜混 浊 的遗传基 础 具 有重 要 的意 义 ， 能够 为 人类 角膜 病 的预 防 、 早 期 诊 断 、治 疗及 其 发 病机 制 的阐 明提 供理 论 依据 。 邵 义 祥 等 建 立 了能 世 代 相 传 、具 有 角膜 混 浊 表 型 的突变 系小 鼠（ ６Ｃ 小 鼠） ， 发现初 生 小 鼠 Ｂ ．ｏ １并 眼 睑开裂 与角膜混浊 存在对应 关系 ： 生小 鼠眼 睑开 新 裂， 长大后 表现 为角膜 混浊 ， 其突变 表型 能世代 相传 ， 经 遗 传 学 研 究 证 实 ，该 鼠属 于 单基 因 显 性遗 传 【 。 ５ １ 蒋 荧梅 等通 过 Ｓ 标 记将 Ｂ ． 小 鼠突 变基 因精 确 ＮＰ ６Ｃｏ 定位 于 ｌ 号染色体 上 １２５ ６２ ３ ｐ一 １ ９ ５ ｐ ３ １ ４ ８ １ ３ ７６４ｂ ｂ ３
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实验动物与 比较医学 Ｌ ｂ ｒｔｒ ｉ ｌｎ ｏ ａａ ｖ ｄｃ ｅ ａ ｏａｏｙ ｍａａ ｄ ｍｐｒｔ ｅＭｅ ｉｉ Ａｎ Ｃ ｉ ｎ
角 膜病 是 我 国主 要 的致 盲眼 病之 一 Ｉ，仅次 于 ”
碱基 之 ］ 这 一区 间 内有 包括 Ａｎ ｒ５ ，在 ｋｄ ５和 Ｄｄ ４ ｘ 在 内的 ５ 己知基 因 。有研 究表 明 ，Ａｎ ｒ ５ 基 因 个 ｋｄ ５ 产 物是 锚蛋 白重 复序列 模体（ ｎ ｙｉ ｐ ａ ｍｏｉ 家 Ａ ｋ ｒ ｒ ｅ ｔ ｔ） ｎｅ ｆ 族成 员之一 ， 功能主要 是参与蛋 白质之 问的相互作 其 用 ： ｘ Ｄｄ ４基 因编码 ＤＥ ＡＤ框 蛋 白， 胚胎 生 成 、 与 精 子 发 生及 分 裂有 关 ８ １ 小 鼠眼 睑 的发 育需 要 。而
李 瑶 吴刘成 卢泽艳 郑 良 ， ， ， ， 凤 葛良玉 邵义祥 ， ， ： （． １ 南通大学实验动物 中心， 南通 ２ ６ ０ ； ． ２０ １ ２ 南通大学比较 医学研究所， 南通 ２ ６０ ） ２０ １
［ 要］ 目的 对 Ｂ 一ｏ小鼠 Ａｎｒ５ 摘 ６Ｃ ｋｄ ５和 Ｄ ｘ 因进行 克 隆测序 分析 ，寻找是 否存 在 突 变位 点 。 ｄ ４基
Ｏ ｔ ０ ２３ （） ｃ． １ ， ５ ２ ２
实验动物 与比较 医学 Ｌ ｂ ｒｔｒ ｉ ｌｎ ｏ ａａｖ ｄｃｎ ａ ｏａ ｙ ｍａａ ｄＣ ｍｐｒｔ ｅ ｏ Ａｎ ｉ Ｍｅ ｉ ｅ ｉ
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Ｂ 一 ｏ小鼠 Ａｎ ｒ ５ ６Ｃ ｋ ｄ ５和 Ｄ ｘ ｄ ４突变
候 选 基 因克 隆及 测 序
物 模 型 。Ｅ ｍａｌｓａ ｙ ＠ｎｕｅｕｃ ． ｉ ｈ ｏ ｘ ｔ． ． ： ｄ ｎ
裂 的 Ｂ６Ｃｏ小 鼠 ，均 符合 清 洁 级标 准 ， 由南 通 大 一
学 实 验动 物 中 ， ＣＸＫ（ ２ ０ ．０ ０ ］ 供 。 Ｉ［ ￣Ｓ 苏）０ ８０ １ ）提 １１ 主要 仪 器和设 备 Ｖ 一４ ． ．． ２ Ｓ ８０ＫＵ型超净工 作 台；
基 因位于小鼠 ｌ 号染色体第 １３ １３９ ３ １４ ２４ 的碱基 由ｃ转换成 Ａ， 导致编码氨基酸的密码子改变，产 物脯氨酸（） Ｐ变成谷氨酰胺（） Ｑ 。结论 Ｄ ｘ 基 因发生单碱基 突变， ｄ４ 表明该突变可能与Ｂ ．ｏ ６ 小鼠 ｃ 的 Ｅ Ｂ表型相关，但是有待于进一步研究。 ０ ［ 关键 词】 ． ｏ小 鼠； Ｂ６Ｃ 角膜 混浊 ； Ｃ Ｐ Ｒ体 外扩 增 ； 因克 隆 基 冲 图分类号］ ７ ５Ｑ ５３ ［ Ｑ ８ ９ —３ 文献标识码】 ［ Ａ 文章编号］ ６４５ １（０ ２ ５０ ３ １ ５ １７ —８ ７２ １） —０ ７ — ０ ０
［ 收稿 日期】２ １—１３ ｏ ２０ —１ ［ 基金项 目】 国家 自然科 学基 金项 目（０ ７ ０ １； 苏省 自然 ３ ６ １８ ）江 科学基金项 目（ Ｋ ０ ０ ７ ） 南通大学 自然科学 Ｂ ２ １ ２ ９；
基 金 项 目（１ ０ ２ １Ｚ ５ ）
胞 死亡 【。 如果这 两 个基 因中任 何一 个基 因突变 影 响 到眼 睑细胞 的生长和 分裂 ，则势 必会对 眼 睑发育 造 成 不 良影 响 ，从 而 有 可 能 导致 初 生 小 鼠眼 睑 开 裂 。因此本 实验 对 Ｂ ． ｏ突变 系和 Ｃ ７ Ｌ６Ｂ６ｄ ６Ｃ ５ Ｂ ／（ ） ， 鼠的 Ａｎ ｒ５ ｋ ｄ ５和 Ｄｄ ４两个 基 因分 别进 行 克隆及 测 ｘ 序 ，分 析 其 是否 存 在 突变 位 点 ，及 是 否 有 可 能 导 致 初 生 小 鼠眼 睑 开 裂 的表 型 。