谷丙转氨酶活性测定

（3）谷丙转氨酶底物： ）谷丙转氨酶底物：
取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸 丙氨酸1.79g置于小 取分析纯 － 酮戊二酸 ， 丙氨酸 置于小 烧杯内， 至完全溶解。 烧杯内 ， 加 1N NaOH约10ml至完全溶解。 用 1N NaOH或1N 约 至完全溶解 或 HCl校正其 校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至 磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加 校正其 ， 磷酸缓冲液稀释至 ， 氯仿数滴防腐， 在冰箱内可保存一周。 此溶液每1.0ml含 α－ 氯仿数滴防腐 ， 在冰箱内可保存一周 。 此溶液每 含 － 酮戊二酸2.0微克分子 丙氨酸200微克分子。 微克分子， 微克分子。 酮戊二酸 微克分子，丙氨酸 微克分子
氢氧化钠液。 （5）0.4N氢氧化钠液。 ） 氢氧化钠液 3、仪器设备 、 试管、吸量管、恒温水浴锅、 试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
三、方法和步骤
1、肝匀浆制备： 肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗， 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸 干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管 称取肝脏0.5g 剪成小块， 0.5 加入4.5ml预冷的 4.5ml预冷的pH mol/L磷酸缓 内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。 10%肝匀浆 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
在各种转氨酶中， 谷氨酸在各种转氨酶中 ， 谷氨酸 - 草酰乙酸转氨酶 简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（ （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。 称谷丙转氨酶）活力最强。 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内 ， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。 在正常人血清中也有少量 ， 机体发生肝炎 。 心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加， 梗塞等病变时 ， 血清中转氨酶活力显著增加 ， 所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义 。 它们的催化反应如下： 它们的催化反应如下：
→
二、实验用品
1、材料 、 新鲜动物肝匀浆。 新鲜动物肝匀浆。 2、试剂 、 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4） 磷酸缓冲液（ ） 磷酸缓冲液 ） 取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， ， 液 ， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 再加蒸馏水 ，混匀即得。 微克分子/ml） （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子 ）： ）丙酮酸钠标准液（ 微克分子 丙酮酸钠11mg溶解于 溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 取A·R丙酮酸钠 丙酮酸钠 溶解于 磷酸缓冲液 宜当日新配） 内（宜当日新配）。
二硝基苯肼溶液： （4）2，4—二硝基苯肼溶液： ） ， 二硝基苯肼溶液
二硝基苯肼19.8mg加入 加入200ml锥形瓶内， 锥形瓶内， 将A·R纯2，4—二硝基苯肼 纯 ， 二硝基苯肼 加入 锥形瓶内 二硝基苯肼溶解较慢， 加100ml 1N HCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶 液 ， 二硝基苯肼溶解较慢 放在暗处不时摇动， 全部溶解后， 滤入褐色玻璃瓶。 放在暗处不时摇动 ， 全部溶解后 ， 滤入褐色玻璃瓶 。 并置于 冰箱中保存。 冰箱中保存。
实验十七 谷丙转氨酶活性测定 Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶, 氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机 体内的酶，其作用为催化α 氨基酸的α 体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与 酮酸的α 酮基互换。 α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成 和分解， 和分解 ， 尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有 重要作用。转氨酶的种类甚多。 重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基酸 进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化， 进行转氨作用时 ， 都由其专一的转氨酶催化 ， 它 们的最适pH接近7 pH接近 们的最适pH接近7.4。
COOH CH3 (CH2)2 转氨酶 CHNH2+ C=O COOH COOH 丙氨酸 α-酮戊二酸 CH3
COOH (CH2)2 + CHNH2 COOH 谷氨酸
←→
C=O COOH 丙酮酸
测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法， 测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸 上层析法等。 在本方法中， 上层析法等 。 在本方法中 ， 谷丙转氨酶作用于丙氨 酸和α 酮戊二酸后， 生成的丙酮酸与2 酸和 α－ 酮戊二酸后 ， 生成的丙酮酸与 2 , 4 － 二硝 基苯肼作用生成丙酮酸2 二硝基苯腙。 基苯肼作用生成丙酮酸2,4－ 二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法， 本方法中用分光光度法 ， 根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。 量可以计算酶的活力。
四、实验结果
用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位 数，计算 100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数 每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
五、思考题
1.谷丙转氨酶活性测定的原理是什么 谷丙转氨酶活性测定的原理是什么? 2.在“空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆 空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆?
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制 1.丙酮酸钠标准曲线的绘制
管号 0 试剂 丙酮酸钠标准液/ml 丙酮酸钠标准液 谷丙转氨酶底物/ml 谷丙转氨酶底物 磷酸缓冲溶液 (0.1M pH7.4) /ml 0.00 0.50 0.10 0.05 0.45 0.10 0.10 0.40 0.10 0.15 0.35 0.10 0.20 0.30 0.10 0.25 0.25 0.10 1 2 3 4 5
2、标准曲线的绘制 支试管分别用0 标号， 取 6 支试管分别用 0 、 1 、 2 、 3 、 5 标号 ， 按下 表所列次序添加各试剂。 表所列次序添加各试剂。 将试管于37 水浴中保温，平衡管内外温度, 37℃ 将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0 向各管内加 0 . 5 ml 2，4—二硝基苯肼后再保 二硝基苯肼后再保 20分钟 分钟， 温20分钟， 最后分别向各管内加入0 毫升， 最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升， 在室温下静置30分钟后， 30分钟后 在室温下静置30分钟后， 号管做“ 空白” 520nm 进行比色， nm进行比色 以 0 号管做 “ 空白 ” 用 520 nm 进行比色 ， 读出 光吸收值， 以丙酮酸的微摩数为横坐标， 光吸收值 ， 以丙酮酸的微摩数为横坐标 ， 光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。 值为纵坐标，画出标准曲线。
37℃水浴中保温， 平衡管 ℃水浴中保温， 2，4-二硝基苯肼 ml 0.50 ， 二硝基苯肼 二硝基苯肼/ 保温20 保温 NaOH (0.4N)/ml A520nm 5 静置30 静置
内外温 0.50 分钟 5 分钟
度 0.50 5 0.50 5 0.50 5 0.50 5
ห้องสมุดไป่ตู้
2、谷丙转氨酶酶活力的测定
表2.谷丙转氨酶酶活力的测定 2.谷丙转氨酶酶活力的测定
1 测定管 谷丙转氨酶底物/ml 谷丙转氨酶底物 0.50 2 “空白”对照管 空白” 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡 ℃水浴保温 ， 稀释肝匀浆/ml 稀释肝匀浆 0.10 37℃水浴保温30分钟 ℃水浴保温 分钟 2,4—二硝基苯肼试剂 二硝基苯肼试剂/ml 二硝基苯肼试剂 稀释肝匀浆/ml 稀释肝匀浆 保温20分钟， 保温 分钟，冷却 分钟 NaOH (0.4N) /ml 5.0 室温下静置30分钟 室温下静置 分钟 A520nm 5.0 0.50 0.50 0.10