谷丙转氨酶活性测定
血清谷丙转氨酶活性的测定改良赖氏法
血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？
血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）
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掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。
【目的要求】
熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。
了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
谷丙转氨酶活力测定
谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。
熟悉转氨酶活性测定的操作方法。
了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。
二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。
参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。
卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。
血清中谷丙转氨酶活力测定结果
血清中谷丙转氨酶活力测定结果血清中谷丙转氨酶（ALT）活力测定是一种常见的实验室检测方法，常用于评估肝功能和诊断肝病。
本文将介绍血清中谷丙转氨酶活力测定结果的相关知识。
血清中谷丙转氨酶活力（ALT）是指血液中存在的一种酶的活性，通常用于评估肝脏功能的状况。
正常情况下，谷丙转氨酶的活力是很低的，一般小于40单位/升。
当肝细胞受损或病变时，会释放ALT，使其活力升高。
高浓度的ALT通常与肝脏病变有关，例如肝炎、肝硬化、脂肪肝、药物性肝病等。
此外，高ALT水平还可能与其他疾病有关，例如急性胰腺炎、心肌梗塞、重型结核等。
因此，如果血清中ALT活力超过正常范围，应及时进行检查和诊断。
血清中ALT测定通常是使用血清学方法进行的。
一般情况下，医师会在胳膊上绑上一条缚带，并在手腕或肘部的静脉内取一小样血液。
样本会送到实验室进行分析。
实验室会使用化学试剂和仪器来测量血清中ALT的活力。
结果会以单位/升（U/L）的形式报告。
正常情况下，成人男性的ALT浓度应在10-40 U/L之间，女性的ALT浓度应在7-35U/L之间。
但这些数值还受到年龄、体重、性别和肝脏状态等因素的影响。
因此，在解读ALT浓度时，医生还需要考虑患者的其他情况。
ALT浓度的升高程度也是确定病情的重要指标之一。
一般来说，当ALT浓度超过正常范围的两倍以上时，就可以诊断为肝炎或其他肝病。
此外，还有一种称为谷草酰转移酶（AST）的酶，也与肝脏有关，但其升高程度不如ALT明显。
需要注意的是，虽然ALT浓度升高可能表明肝脏病变，但不能单独确定肝病的类型和严重程度。
医生还需要进行其他检查和评估，例如肝脏超声、CT扫描、肝组织活检等，以帮助确定具体的病情。
总之，血清中ALT活力测定是一种常见的实验室检测方法，通常用于评估肝脏功能和诊断肝病。
需要注意的是，结果需要结合患者的其他情况进行解读，以便更准确地诊断和治疗肝病。
血清谷丙转氨酶测定
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COOH
C NH2 CH3 Ala
COOH
COOH
谷丙转氨酶
+ CO
CO
(CH2)2
CH3
COOH
丙酮酸
α-KG
COOH + C NH2
(CH2)2 COOH
Glu
NO2
COOH CO
+ H2N
HN
NO2
CH3
2，4-二硝基苯肼
0
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COOH
NO2
C N HN
CH3
NO2
丙酮酸-2，4-二硝基苯腙 棕红色，520nm处具特征光 吸收，颜色深浅（OD520值） 与丙酮酸含量成正比，可据
transaminase GOT
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–当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿
胀、坏死导致大量的酶释放到血流中，从而引起血清谷
丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶(GOT)活性显著升高。因
此测定这些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的
参考价值。
本试验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物 (基质液 成分)经血清谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及丙酮酸。丙
28
57
97
150 200
2,4-二硝基苯肼 ml
0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴保温 20min
氢氧化钠 ml
5.0 5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
室温下静置10min
0号管调零，于520nm处测吸光度
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GPT活力测定：洁净干燥试管2支， 即测定管、对照管各1支
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四、实验操作
肝脏谷丙转氨酶活力测定
一、实验目的
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙 酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此 物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色， 求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
C O O H 500：标准丙酮酸浓度 2.
37℃ 水浴5 分钟
0.1
0.1（标准丙酮酸） 0.1
混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟
0.1（H2O）
0.5
0.5
0.5
0.5
——
——
0.5
0.5
混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟
各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000
六. 附注
➢2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异 性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而 显色。 ➢2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白 管颜色较深。
2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
C H 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2. 2 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） C H 2 C H 3 5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
S ×2.
C H N H 新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 2 5：谷丙转氨酶换算单位 C O O H 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 现配 2.谷丙转氨酶底物 4℃，1周
二硝基苯肼溶液
6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣
谷丙转氨酶活性测定
2、标准曲线的绘制 取 6 支试管分别用 0 、 1 、 2 、 3 、 5 标号，按下 表所列次序添加各试剂。 将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加 0.5ml 2，4— 二硝基苯肼后再保 温20分钟， 最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升， 在室温下静置30分钟后， 以 0 号管做“空白”用 520nm 进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
0.35 0.10
0.30 0.10
0.25 0.10
37℃水浴中保温， 平衡管 2，4-二硝基苯肼/ ml 0.50 保温20
0.50
0.50
0.50
NaOH (0.4N)/ml
A520nm
5
静置30
5
分钟
5
5
5
5
2、谷丙转氨酶酶活力的测定
表2.谷丙转氨酶酶活力的测定
1 测定管 谷丙转氨酶底物/ml 0.50 2 “空白”对照管 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡
稀释肝匀浆/ml 0.10 37℃水浴保温30分钟 2,4—二硝基苯肼试剂/ml 稀释肝匀浆/ml 0.50 0.50 0.10
保温20分钟，冷却
NaOH (0.4N) /ml 5.0 室温下静置30分钟 A520nm 5.0
四、实验结果
用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位 数，计算 每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
（4）2，4—二硝基苯肼溶液：
实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定
实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。
或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的使用。
【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。
它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。
当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。
现用现配。
2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。
然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶的测定实验报告引言：血清谷丙转氨酶（AST）是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，主要参与氨基酸代谢过程。
AST的测定在临床上具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。
本实验旨在通过酶促动力学方法测定血清中AST的活性，并分析实验结果。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 血清标本：从健康志愿者采集的血样。
- AST测定试剂盒：包括底物、辅酶、酶标试剂等。
- 酶标仪：用于测定底物的光吸收值。
2. 实验方法：- 步骤一：标定酶标仪将已知浓度的AST酶标溶液分别加入不同的试管中，测定其对应的光吸收值，建立标准曲线。
- 步骤二：制备样本将采集到的血清标本离心，取上清液，稀释至适宜浓度。
- 步骤三：测定AST活性将标定好的试剂和稀释后的血清标本加入试管中，混匀后，放入酶标仪中测定吸光度。
- 步骤四：计算AST活性根据标准曲线，计算出各个样本的AST活性。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一系列样本的AST活性数据。
根据标准曲线，我们可以计算出每个样本的AST活性，并进行进一步的分析。
首先，我们可以观察到不同样本之间AST活性的差异。
正常情况下，AST活性在一个相对稳定的范围内，超出该范围可能提示肝脏功能异常或疾病存在。
因此，通过测定AST活性，我们可以初步判断一个人的肝脏健康状况。
其次，我们还可以对不同条件下AST活性的变化进行研究。
例如，我们可以比较不同性别、不同年龄段、不同体重指数的人群的AST活性是否存在差异。
这样的研究有助于进一步了解AST在人体内的生理变化和代谢过程。
此外，我们还可以将AST活性与其他临床指标进行关联分析。
例如，我们可以比较AST活性与肝功能指标、炎症指标等之间的关系。
这些关联分析可以为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。
总结：通过本实验，我们成功地测定了血清中AST的活性，并对实验结果进行了分析和讨论。
AST的测定在临床中具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
实验八 肝脏谷丙转氨酶活力测定实验类型：验证性实验相关知识1. 酶活力：2. 酶活力单位(即酶含量的多少)国际单位 习惯单位：谷丙转氨酶在37度与底物作用30min 后，能产生2.5ug 的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位 3.转氨酶4 谷丙转氨酶一、 实验目的1． 了解转氨酶的性质及临床意义 2． 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理丙氨酸及α－酮戊二酸作用为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。
丙酮酸能与2,4－二硝基苯肼结合，生成丙酸－2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm ，可用于测定丙酮酸的含量。
α－酮戊二酸也能与2,4－二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸－2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm 波长比色时，丙酸－2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。
在520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α－酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。
三、实验器材、试剂、材料 1． 新鲜猪猪脏2． 722型分光光度计、剪刀、吸管3． 标准丙酮酸溶液；谷丙转氨酶底物；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）；0.02%2,4－二硝基苯肼；0.4mol/L NaOH 溶液2 ＋辅基为磷2 2 + + ‘ ‘四、实验操作步聚1.肝匀浆制备（1）将猪肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。
（每四组1份）（2）吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）（每四组1份）2.谷丙转氨酶活力测定（每组做1份）取试管4支按下表加液五、实验结果与讨论2.每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（谷丙转氨酶活力计算：规定酶在37度与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位）3.每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。
血清谷-丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)
将采集的血清样本进行适当的处理，如离心、过滤等，以去 除杂质和分离出血清部分。
实验操作步骤
实验操作
按照实验步骤，逐步进行实验操作，包括加样、反应、比色等。
实验记录
在实验过程中，详细记录实验数据和结果，以便后续的数据分析和处理。
04
结果分析
数据记录
总结词：准确记录
详细描述：在测定过程中，应准确记录每个步骤的数据，包括样本编号、试剂用 量、反应时间、温度等，以确保结果的准确性和可追溯性。
THANKS
感谢观看
05
实验结论
数据总结
实验数据
通过改良赖氏法测定，得到各样本的血清谷-丙转氨 酶活性数据。
数据处理
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、变 异系数等。
数据可靠性
确保实验数据的准确性和可靠性，排除异常值和离群 点。
实验结论
正常参考值范围
根据实验数据，确定正常参考值范围，为临床 诊断提供依据。
结果计算
总结词：科学计算
详细描述：根据实验原理和公式，对实验数据进行科学计算，得出谷-丙转氨酶的活性值。计算过程需注意单位的统一和数值 的精度。
结果解读
总结词：综合分析
详细描述：结合患者病情、肝功能其他指标以及肝功能检查的历史数据，对谷-丙转氨酶活性测定结果 进行综合分析，判断肝脏功能状况，为临床诊断和治疗提供依据。
通过加入溴代十六烷基三甲胺，可以减少反应 液中其他酶对谷丙转氨酶活性测定的干扰，提 高测定结果的准确性。
实验注意事项
实验前应确保血清样本无溶血、黄疸或脂血现象，以免影响测定结果。 实验过程中应严格控制反应温度和时间，以确保反应完全和测定结果的准确性。
在测定过程中应避免接触有毒物质，如重氮基苯磺酸铵等，以免对健康造成危害。
谷丙转氨酶活性检测
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
精品医学ppt
5
2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
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七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
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六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、［实验目的］1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4. 了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。
二、［仪器与试剂］1.实验材料动物肝脏2.实验试剂(1) 0.9%NaCl 溶液(2)海砂(3)1%谷氨酸溶液(1%KOH溶液中和)(4)1%丙酮酸钠溶液(用1%KOH溶液中和)(5)0.1%KHCO廨液3(6)0.025%—澳乙酸溶液(用1%KOH中和)(7)2%乙酸溶液(8)酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水(按重量计算)混合，放入分液漏斗中，振荡。
静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。
新配制的酚展层剂可以反复使用1周。
(9)0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液(10)0.1%标准谷氨酸溶液(11)0.1%标准丙氨酸溶液(12)1%KOH 溶液谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、［实验原理］观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。
通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。
为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂澳乙酸。
二、［实验操作］1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。
2.转氨作用沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。
用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。
转氨酶测定实验报告原理
一、实验背景转氨酶（Transaminase）是一类催化氨基酸与酮酸之间氨基转移反应的酶类，广泛存在于生物体内。
在人体中，转氨酶主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌等组织中，其中以肝脏中的活性最高。
转氨酶在氨基酸的合成与分解、蛋白质代谢、能量代谢等过程中发挥着重要作用。
血清转氨酶水平是反映肝细胞损伤程度的重要指标，对于肝脏疾病的诊断和监测具有重要意义。
二、实验原理1. 转氨酶活性测定方法目前，测定转氨酶活性的方法主要有紫外分光光度法、化学比色法等。
本实验采用紫外分光光度法测定血清谷丙转氨酶（SGPT）活性。
2. 实验原理（1）谷丙转氨酶（SGPT）催化丙氨酸（Ala）与α-酮戊二酸（α-KG）之间的氨基转移反应，生成谷氨酸（Glu）和丙酮酸（Pyruvate）。
Ala + α-KG → Glu + Pyruvate（2）生成的丙酮酸在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙（2，4-DNP-Pyruvate）。
Pyruvate + 2，4-DNPH → 2，4-DNP-Pyruvate（3）丙酮酸2，4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕色，可通过紫外分光光度法测定其吸光度，从而计算出谷丙转氨酶的活性。
三、实验步骤1. 准备工作（1）配制丙氨酸-α-酮戊二酸底物溶液：将一定量的丙氨酸和α-酮戊二酸溶解于缓冲溶液中，配制成一定浓度的底物溶液。
（2）配制2，4-二硝基苯肼溶液：将2，4-二硝基苯肼溶解于一定浓度的盐酸溶液中，配制成一定浓度的溶液。
（3）配制碱性溶液：将氢氧化钠溶解于去离子水中，配制成一定浓度的碱性溶液。
2. 样品处理（1）取一定量的血清样品，加入适量去离子水，混匀。
（2）取一定量的血清样品，加入适量的丙氨酸-α-酮戊二酸底物溶液，混匀。
（3）将混合液置于37℃水浴中保温一定时间。
3. 反应终止取一定量的混合液，加入适量的2，4-二硝基苯肼溶液，混匀。
4. 测定吸光度在特定波长下，测定混合液的吸光度。
实验十一 谷丙转氨酶活性的测定
A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。 B.将试管置于37℃水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。 C.分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。 D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。 E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。
应
用
• GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病 毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液 中，使血清中此酶水平明显要指标。
实验方法
1.标准曲线的制备
0 2mM丙酮酸标准溶液 （ml） 磷酸缓冲液（ml） GPT底物溶液（ml） 0.00 0.25 0.50 1 0.05 0.20 0.50 2 0.10 0.15 0.50 3 0.15 0.10 0.50 4 0.20 0.05 0.50 5 0.25 0.00 0.50
2、严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。
2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照下表添加试剂。
试剂
鱼肌肉匀浆液（ml） GPT底物溶液（ml）
测定1
0.25 0.50
对照1
0.25
测定2
0.25 0.50
对照2
0.25
37 ℃水浴加热30min（转氨基反应） 2,4-二硝基苯肼（ml） GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37 ℃水浴加热20min（丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应） 0.4mol/L氢氧化钠溶液 （ml） 5.00 5.00 5.00 5.00
各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调 节零点，测定1和2号管的吸收值。
血清谷丙转氨酶活性的测定改良赖氏法
试剂二
取0.1mol/L的磷酸缓冲液50mL， 加入0.5%的溴麝香草酚蓝溶液 1.5mL，用0.1mol/L的氢氧化钠 溶液调节pH至7.4，最后加蒸馏 水至100mL。
试剂三
取0.1mol/L的磷酸缓冲液50mL， 加入4%的碳酸氢钠溶液5mL， 用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节
ALT催化反应
在37℃水浴中，将混合液加入含有ALT催化底物的反应体系中，启动催化反应。
NADH消耗检测
通过分光光度计在340nm波长处监测反应体系中NADH的吸光度变化，记录数据。
数据处理与结果计算
根据吸光度变化计算ALT活性，并给出结果报告。
02 实验材料
CHAPTER
试剂准备
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）
实验过程中产生的废液应按照实验室规定正确处理，避免对环境造 成污染。
遵守实验室安全规定
实验人员应严格遵守实验室安全规定，确保实验过程的安全性。
误差控制
保证试剂质量
01
使用高质量的试剂，确保试剂的准确性和稳定性，降低误差。
标准化操作
02
实验人员应遵循标准化操作流程，避免因操作不当引起的误差。
定期校准仪器
用于配制磷酸盐缓冲液，提供反应所需的pH环境。
赖氏试剂（Reitman-Frankel reage…
由NAD+、赖氏酸和缓冲液组成，用于提供反应所需的辅酶和还原剂。
血清样本
用于测定谷丙转氨酶活性，应确保血清中无细菌污染和溶血现象。
仪器设备
分光光度计
用于测定反应过程中吸 光度的变化，进而计算 酶活性。
恒温水浴
用于维持反应温度，通 常设定在37°C。
血清谷丙转氨酶实验报告
一、实验目的通过本实验，了解血清谷丙转氨酶（SGPT）的测定原理、方法及临床意义，掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活性的操作技能。
二、实验原理谷丙转氨酶（ALT）是一种催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸之间氨基转移的酶，主要存在于肝细胞内。
当肝细胞受到损害时，ALT会从细胞内释放到血液中，导致血清ALT活性升高。
本实验采用分光光度法测定血清ALT活性，通过测定ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的吸光度，从而计算出ALT的活性。
三、实验材料1. 试剂：丙氨酸标准品、α-酮戊二酸标准品、2，4-二硝基苯肼、磷酸盐缓冲液、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾等。
2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验方法1. 标准曲线绘制（1）配制丙氨酸标准溶液：准确称取丙氨酸标准品，用磷酸盐缓冲液溶解并定容，配制成0.1mmol/L的丙氨酸标准溶液。
（2）取六支试管，分别加入0.1mmol/L丙氨酸标准溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，各加入磷酸盐缓冲液至1.0ml。
（3）向各试管中加入2，4-二硝基苯肼0.2ml，混匀，37℃水浴30min。
（4）加入氢氧化钠溶液1.0ml，混匀，显色30min。
（5）用分光光度计在540nm波长处测定各试管吸光度，以丙氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清ALT活性测定（1）取血清样本0.1ml，加入磷酸盐缓冲液至1.0ml。
（2）按标准曲线绘制方法，测定血清样本吸光度。
（3）根据标准曲线，计算血清ALT活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以丙氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为：Y = 0.0678X - 0.0011，相关系数R²=0.9968。
2. 血清ALT活性测定测定血清样本吸光度为0.560，根据标准曲线计算血清ALT活性为0.9mmol/L。
临床检测--谷丙转氨酶活性的测定
临床检测--谷丙转氨酶活性的测定临床检测是医学领域中非常重要的一部分，通过检测患者的生物样本中的各种生化指标，可以用来评估患者的健康状况和疾病的发展程度。
谷丙转氨酶（alanine transaminase，简称ALT）是一种重要的生物标志物，常用于评估患者的肝功能。
ALT是一种存在于细胞质中的酶，其主要在肝脏中和一部分在心肌、脾脏、肾脏中含量较低。
正常情况下，ALT的活性比较低，当肝细胞受到损伤时，ALT会被释放入血液中，导致血液中ALT活性的升高。
因此，通过检测血液中的ALT活性可以间接地了解患者的肝脏功能状况和肝细胞的损伤程度。
谷丙转氨酶活性的测定方法有多种，常用的方法有光度法、比色法和酶动力学法等。
其中，最常用的方法是利用光度法进行测定。
这种方法通过测量分析物的吸光度来确定其浓度，从而获得谷丙转氨酶活性的结果。
光度法的测定原理是谷丙转氨酶与特定底物反应生成特定产物，这种产物在特定波长下具有特定的吸光度。
通过测量产物的吸光度可以计算出样本中的谷丙转氨酶活性。
光度法测定谷丙转氨酶活性通常需要使用专用的仪器设备，如分光光度计、酶标仪等。
首先，需要准备好标准品和待测样品。
标准品是已知浓度的谷丙转氨酶，其活性单位为每升（U/L）。
待测样品可以是血浆或血清，通常需要先将其离心去除悬浮物，获得清晰的样本。
测定时，将待测样品和标准品分别加入反应试剂中，反应试剂含有特定的底物和辅酶。
然后，在恒定温度下，将反应混合物置于光度计或酶标仪中进行反应，反应时间一般为30分钟。
反应结束后，测定光度计读取每个反应混合物的吸光度并记录下来。
根据标准品的测定结果，可以建立起标准曲线。
标准曲线是以标准品浓度为X轴，吸光度为Y轴所绘制的曲线。
然后，利用待测样品的测定结果和标准曲线，可以计算出待测样品中谷丙转氨酶的活性。
在进行谷丙转氨酶活性测定时，需要注意一些技术细节。
首先，样本的处理过程中需要注意保持样本的稳定性和完整性，避免悬浮物的干扰。
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COOH CH3 (CH2)2 转氨酶 CHNH2+ C=O COOH COOH 丙氨酸 α-酮戊二酸 CH3
COOH (CH2)2 + CHNH2 COOH 谷氨酸
←→
C=O COOH 丙酮酸
测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法， 测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸 上层析法等。 在本方法中， 上层析法等 。 在本方法中 ， 谷丙转氨酶作用于丙氨 酸和α 酮戊二酸后， 生成的丙酮酸与2 酸和 α－ 酮戊二酸后 ， 生成的丙酮酸与 2 , 4 － 二硝 基苯肼作用生成丙酮酸2 二硝基苯腙。 基苯肼作用生成丙酮酸2,4－ 二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法， 本方法中用分光光度法 ， 根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。 量可以计算酶的活力。
2、标准曲线的绘制 支试管分别用0 标号， 取 6 支试管分别用 0 、 1 、 2 、 3 、 5 标号 ， 按下 表所列次序添加各试剂。 表所列次序添加各试剂。 将试管于37 水浴中保温，平衡管内外温度, 37℃ 将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0 向各管内加 0 . 5 ml 2，4—二硝基苯肼后再保 二硝基苯肼后再保 20分钟 分钟， 温20分钟， 最后分别向各管内加入0 毫升， 最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升， 在室温下静置30分钟后， 30分钟后 在室温下静置30分钟后， 号管做“ 空白” 520nm 进行比色， nm进行比色 以 0 号管做 “ 空白 ” 用 520 nm 进行比色 ， 读出 光吸收值， 以丙酮酸的微摩数为横坐标， 光吸收值 ， 以丙酮酸的微摩数为横坐标 ， 光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。 值为纵坐标，画出标准曲线。
实验十七 谷丙转氨酶活性测定 Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶, 氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机 体内的酶，其作用为催化α 氨基酸的α 体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与 酮酸的α 酮基互换。 α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成 和分解， 和分解 ， 尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有 重要作用。转氨酶的种类甚多。 重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基酸 进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化， 进行转氨作用时 ， 都由其专一的转氨酶催化 ， 它 们的最适pH接近7 pH接近 们的最适pH接近7.4。
氢氧化钠液。 （5）0.4N氢氧化钠液。 ） 氢氧化钠液 3、仪器设备 、 试管、吸量管、恒温水浴锅、 试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
三、方法和步骤
1、肝匀浆制备： 肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗， 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸 干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管 称取肝脏0.5g 剪成小块， 0.5 加入4.5ml预冷的 4.5ml预冷的pH mol/L磷酸缓 内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。 10%肝匀浆 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
→
二、实验用品
1、材料 、 新鲜动物肝匀浆。 新鲜动物肝匀浆。 2、试剂 、 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4） 磷酸缓冲液（ ） 磷酸缓冲液 ） 取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， ， 液 ， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 再加蒸馏水 ，混匀即得。 微克分子/ml） （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子 ）： ）丙酮酸钠标准液（ 微克分子 丙酮酸钠11mg溶解于 溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 取A·R丙酮酸钠 丙酮酸钠 溶解于 磷酸缓冲液 宜当日新配） 内（宜当日新配）。
表2.谷丙转氨酶酶活力的测定 2.谷丙转氨酶酶活力的测定
1 测定管 谷丙转氨酶底物/ml 谷丙转氨酶底物 0.50 2 “空白”对照管 空白” 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡 ℃水浴保温 ， 稀释肝匀浆/ml 稀释肝匀浆 0.10 37℃水浴保温30分钟 ℃水浴保温 分钟 2,4—二硝基苯肼试剂 二硝基苯肼试剂/ml 二硝基苯肼试剂 稀释肝匀浆/ml 稀释肝匀浆 保温20分钟， 保温 分钟，冷却 分钟 NaOH (0.4N) /ml 5.0 室温下静置30分钟 室温下静置 分钟 A520nm 5.0 0.50 0.50 0.10
二硝基苯肼溶液： （4）2，4—二硝基苯肼溶液： ） ， 二硝基苯肼溶液
二硝基苯肼19.8mg加入 加入200ml锥形瓶内， 锥形瓶内， 将A·R纯2，4—二硝基苯肼 纯 ， 二硝基苯肼 加入 锥形瓶内 二硝基苯肼溶解较慢， 加100ml 1N HCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶 液 ， 二硝基苯肼溶解较慢 放在暗处不时摇动， 全部溶解后， 滤入褐色玻璃瓶。 放在暗处不时摇动 ， 全部溶解后 ， 滤入褐色玻璃瓶 。 并置于 冰箱中保存。 冰箱中保存。
在各种转氨酶中， 谷氨酸在各种转氨酶中 ， 谷氨酸 - 草酰乙酸转氨酶 简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（ （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。 称谷丙转氨酶）活力最强。 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内 ， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。 在正常人血清中也有少量 ， 机体发生肝炎 。 心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加， 梗塞等病变时 ， 血清中转氨酶活力显著增加 ， 所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义 。 它们的催化反应如下： 它们的催化反应如下：
（3）谷丙转氨酶底物： ）谷丙转氨酶底物：
取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸 丙氨酸1.79g置于小 取分析纯 － 酮戊二酸 ， 丙氨酸 置于小 烧杯内， 至完全溶解。 烧杯内 ， 加 1N NaOH约10ml至完全溶解。 用 1N NaOH或1N 约 至完全溶解 或 HCl校正其 校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至 磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加 校正其 ， 磷酸缓冲液稀释至 ， 氯仿数滴防腐， 在冰箱内可保存一周。 此溶液每1.0ml含 α－ 氯仿数滴防腐 ， 在冰箱内可保存一周 。 此溶液每 含 － 酮戊二酸2.0微克分子 丙氨酸200微克分子。 微克分子， 微克分子。 酮戊二酸 微克分子，丙氨酸 微克分子
37℃水浴中保温， 平衡管 ℃水浴中保温， 2，4-二硝基苯肼 ml 0.50 ， 二硝基苯肼 二硝基苯肼/ 保温20 保温 NaOH (0.4N)/ml A520nm 5 静置30 静置
内外温 0.50 分钟 5 分钟
度 0.50 5 0.50 5 0.50 5 0.50 5
2、谷丙转酸钠标准曲线的绘制
管号 0 试剂 丙酮酸钠标准液/ml 丙酮酸钠标准液 谷丙转氨酶底物/ml 谷丙转氨酶底物 磷酸缓冲溶液 (0.1M pH7.4) /ml 0.00 0.50 0.10 0.05 0.45 0.10 0.10 0.40 0.10 0.15 0.35 0.10 0.20 0.30 0.10 0.25 0.25 0.10 1 2 3 4 5
四、实验结果
用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位 数，计算 100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数 每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
五、思考题
1.谷丙转氨酶活性测定的原理是什么 谷丙转氨酶活性测定的原理是什么? 2.在“空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆 空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆?