食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定

食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定

1 原理

油脂经皂化处理后生成游离脂肪酸，其中的长碳链不饱和脂肪酸（EPA和DHA）经甲酯化后挥发性提高。可以用色谱柱有效分离，用氢火焰离子化检测器检测，使用外标法定量。

2试剂

2.1 正己烷：分析纯，重蒸；

2.2 甲醇：优级纯；

2.3 2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液：称取8g氢氧化钠溶于100mL甲醇中。

2.4 2mol/L盐酸-甲醇溶液：把浓硫酸小心滴加在约100g的氯化钠上，把产生的氯化氢气体通入事先量取的约470mL甲醇中，按质量增加量换算，调制成2mol/L盐酸-甲醇溶液，密闭保存在冰箱内。

2.5 二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸标准溶液：精密称取EPA、DHA各50.0mg，加入正己烷溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含0.50mgDHA；

3仪器

3.1 气象色谱仪附有氢火焰离子化检测器（FID）。

3.2 索氏提取器。

3.3 氯化氢发生系统（启普发生器）。

3.4 刻度试管（待分刻度）：2ml、5ml、10ml。

3.5 组织捣碎机。

3.6 旋涡式震荡混合器。

3.7 旋转蒸发仪。

4试样制备

4.1海鱼类食品：用蒸馏水冲洗干净晾干，先切成碎块去除骨骼，然后用组织捣碎机捣碎、混匀，称取样品50g置于250ml具塞碘量瓶中，加100ml-200ml石油醚（沸程30℃-60℃），充分摇匀后，放置过夜，用快速滤纸过滤，减压蒸馏挥干溶剂，得到油脂后称重备用（可计算提油率）。

4.2添加食品：称取样品10g置于60ml分液漏斗中，用60ml正己烷分三次萃取（每次振摇萃取10min）,合并提取液，在70℃水浴上挥至近干，备用。

4.3 鱼油制品：直接进行样品前处理。

5 分析步骤

5.1 皂化

5.1.1 鱼油制品和海鱼类食品：取鱼油制品或经处理得到的海鱼油脂1g于50ml 具塞容量瓶中，加入10ml正己烷轻摇使油脂溶解，并用正己烷定容至刻度。吸取此溶液1.00-5.00ml于另一10ml具塞比色管中，再加入2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液1ml，充分震荡10min后放入60℃水浴中加热1min-2min，皂化完成后，冷却到室温，待甲酯化用。

5.1.2 添加食品：用2ml-3ml正己烷分两次将经5.4.2处理而得的浓缩样液小心转至10ml具塞比色管中，再加入2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液1ml，充分震荡10min 后放入60℃水浴中加热1min-2min，皂化完成后，冷却到室温，待甲酯化用。5.2 甲酯化

5.2.1 标准溶液系列：准确吸取配制的标准溶液1.0、2.0、5.0ml分别移入10ml 具塞比色管中，再加入2mol/L盐酸-甲醇溶液2ml，充分震荡10min，并于50℃的水浴中加热2min，进行甲酯化，弃去下层液体，再加约2ml蒸馏水洗净并去除水层，用滴管吸出正己烷层，移至另一装有无水硫酸钠的漏斗中脱水，将脱水后的溶液在70℃水浴上加热浓缩，定容至1ml，待上机测试用。此标准系类中DHA或EPA的浓度依次为0.5、1.0、2.5mg/mL。

5.2.2 样品溶液：在经皂化处理后的样品溶液中加入2mol/L盐酸-甲醇溶液2ml，充分震荡10min，并于50℃的水浴中加热2min，进行甲酯化，弃去下层液体，再加约2ml蒸馏水洗净并去除水层，用滴管吸出正己烷层，移至另一装有无水硫酸钠的漏斗中脱水，将脱水后的溶液在70℃水浴上加热浓缩，定容至1ml，待上机测试用。此标准系类中DHA或EPA的浓度依次为0.5、1.0、2.5mg/mL。

6 气相色谱测定

6.1色谱柱

玻璃柱1m×4mm(id)，填充涂有10%DEGS/Chromosorb W DMCS 80目-100目的担体。

6.2气体及气体流速

氮气50mL/min 、氢气70mL/min 、空气100mL/min 。

6.3系统温度

色谱柱185℃、进样口210℃、检测器210℃。

7测定

7.1 标准曲线制作：分别吸取经甲酯化处理后的标准溶液 1.0μL ，注入气相色谱仪中，可测得不同浓度EPA 甲酯、DHA 甲酯的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高相应值为纵坐标，绘制标准曲线。

7.2 把经甲酯化处理后的样品溶液1.0μL-5.0μL 注入气相色谱仪中，以保留时间定性，以测得的峰高响应值与标准曲线比较定量。

8计算

8.1 海鱼类（以脂肪计）按下式计算： X=2

13V m V V A ⨯⨯⨯ 8.2 鱼油制品按下式计算：

2

13V m V V A X ⨯⨯⨯= 8.3 添加食品按下式计算：

m

V A X 3⨯= 式中：

X ——试样中二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸的含量，单位为毫克每克（mg/g ）； A ——被测定样液中二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL ）；

V1——鱼油和海鱼类试样皂化前定容总体积，单位为毫升（mL ）；

V2——鱼油和海鱼类试样用于皂化样液体积，单位为毫升（mL ）；

V3——样液最终定容体积，单位为毫升（mL ）；

m ——样品的质量，单位为克（g ）。

计算结果保留两位有效数字。

9精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。