二十二碳六烯酸海藻糖酯的分离纯化及鉴定

孙月娥,夏文水,陈 洁

*

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122)

摘 要:在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖为原料,通过固定化脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯,并对其分离纯化方法进行研究。确定DHA 海藻糖酯的薄层层析(TLC )条件:展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v /v/v),碘蒸气显色10m i n ;硅胶柱层析条件:正己烷/异丙醇/甲醇(5/4/1和4/4/2,v/v/v)梯度洗脱,流速113mL /m in ,1管/7m i n 收集洗出液;用半制备高效液相色谱(H PLC)进一步纯化单酯收集液,经分析型HPLC 检测纯度后用核磁共振(NMR )方法进行结构鉴定,确定为DHA 藻糖单酯。

关键词:二十二碳六烯酸(DHA ),海藻糖酯,固定化脂肪酶,纯化,核磁共振(NMR)

Separati o n ,purifi c ati o n and i d entifi c ati o n

of docosahexaenoy l treha l o se

SUN Yue -e ,X I A W en -shu,i CHEN Jie

*

(S tate Key Laboratory of Food Science and Technology ,Ji angnan Un i versity ,Wuxi 214122,Ch i na)

Abstrac:t Docosahexaenoyl treha l ose(DHA)w as synthes i z ed from d ocosahexaeno i c ac i d e t hyl es t e r and treha l ose i n t e rt -bu tano lus i ng m i m ob ili z ed l i pase as b i oca ta l y s t 1The pu rifi cati on and ana l ys i s m e thod s w e r e i nves ti g ated 1The

m ob il e p hase f o r the t h i n l aye r ch rom atog rap hy(TLC )w as e thy l ace tate /m e thano l/w a ter(815/1/015,v /v /v)and i o d i ne w as used f o r d eve l opm ent 1The s ili c a ge l co l um n chrom a t og rap hy cond iti o ns w e re as f o ll ow s :g rad i en t m ob il e p hases o f hexane-i sop ropano l -m e thano l5B 4B 1(v /v /v)and 4B 4B 2(v /v /v)w ere used i n turn 1The fl o w rate w as 113m L/m i n and the e l u en t o f 1t ube /7m i n w as co ll e c t ed 1The e l uent o f m ono-docosahexaenoyl treha l ose w as p uri fi e d w it h sem i -p repa ra ti v e h i g h pe rf o r m ance li q u i d ch rom atog raphy HPLC f u rthe r and t hen w as i den tifi e d by nuc l e a rm agne ti c resonance(NMR)1Key w ords :docosahexaeno i c ac i d(DHA);docosahexaenoyl treha l o se;m i m ob ili zed l i pase;pu rifi cati on ;NMR

中图分类号:TS20112+

3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2010)03-0200-04收稿日期:2009-05-05 *通讯联系人

作者简介:孙月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向:食品脂质氧化。基金项目:国家自然科学基金课题(20401007)以及江苏省创新人才基

金课题(BK2006503)支持。

非水相酶法催化酯交换反应是一个崭新的研究领域,与传统的化学合成法相比,酶催化合成具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点。大量研究证实,DHA 为人体必需的多不饱和脂肪酸,具有抑制

血小板凝聚、抗血栓、防治心脑血管疾病[1]

、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2]

、

促进智力发育等功能[3]

,此外,还具有抗肿瘤作用[4-5]

。海藻糖是天然双糖中较稳定的二糖,无还原性,在食品中加热不发生美拉德反应。海藻糖作为一种天然二糖,它不仅具有其它低聚糖的特性,而且还具有独特的生物活性)))对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用[6]

。研究表明,许多生物在胁迫环境(如饥饿、高

温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等)下表现出的

抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系[7-8]

。因此,通过酯交换反应把海藻糖和DHA 结合成酯能同时发挥两种活性成分的生物学功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯的分离纯化方法和鉴定方法,即通过薄层层析、硅胶柱层析和半制备反相HPLC 分离纯化目标产物,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用系统(LC -ESI -M S)及核磁共振技术对DHA 海藻糖单酯进行鉴定。

1 材料与方法

111 材料与设备

硅胶(200~300目)、硅胶板(G254) 青岛海洋化工;甲醇(色谱纯) 江苏汉邦科技有限公司;海藻糖(食品级) 日本林原公司;DHA 乙酯(含量>75%) 无锡市迅达海洋生物制品厂赠送;4!分子筛、叔丁醇及其它有机溶剂 分析纯,中国医药集团上海试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozy m 435 诺