抗原获取与抗体制备(1)
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％为IgG） – 离子交换层析法：（IgG） – 酶解法制备F（ab’）2片段
单克隆抗体的制备
• 单克隆抗体（McAb）：由一个识别一种抗原表 位的B细胞克隆产生的一种化学结构完全相同， 高度均一特异性的抗体即同源抗体。
• 多克隆抗体：Ag分子具有多个表位，每个表位 均可刺激B细胞产生一种特异性Ab，而我们免 疫动物用含多种表位的Ag，所获得的抗血清也 是含有多种Ab的混合物，特异性差，易引起交 叉反应。
• 常用吸收光谱分析法测定偶联到载体上的半抗原 数量。
合成肽抗原制备
• 肽的合成与纯化 • 用化学方法将活化的氨基酸聚合，成为多肽。 • 免疫原性肽的选择 • 常选择对应于蛋白质氨基或羧基端10-15个氨基
酸的短肽，通过化学交联到载体蛋白。
• 合成肽必须与蛋白质载体连接后才可有效 刺激机体产生特异性抗体。
快放法：放血快，动物死亡快
– 在动物颈外侧切开分离颈总动脉，远心 端结扎，近心端止血钳夹住。
– 在结扎处剪断血管，将血管放入瓶中， 慢慢打开止血钳，动脉血喷射入瓶。
心脏采血法：
• 豚鼠、大鼠、鸡（小动物） • 穿刺不准，引起动物急性死亡。
静脉多次采血法：得血量最多 （隔日一次）
• 羊：一次300ml，立即回输10%葡萄糖盐水， 3天后，可采血200~300ml，休息7天，再 加强免疫1次，再可采2次血。总血量： 1500~2000ml。
纯化抗原的浓缩与保存
• 超滤浓缩： • 将纯化的抗原在压力作用下通过一定孔径的滤
膜，溶液与小分子物质可通过滤膜，而大分子则 不能，被保留在膜上。加入小体积的缓冲液溶解 回收。 • 通过超滤，蛋白抗原的稀释液可浓缩到原来的 10～15%，回收达90%以上。
纯化抗原的浓缩与保存
• 浓缩后的蛋白可以封装存储。 • 加入防腐剂：甲苯、氯仿、叠氮钠、硫柳汞等； • 加入稳定剂：甘油、蔗糖等. • 低温干燥保存，0～4度稳定保存数年
需要佐剂就可诱导机体产生针对半抗原的高效价 、高亲和力和高特异性抗体。
半抗原与大分子载体的连接
• 化学法：利用功能基团把半抗原连接到载 体上。
• 戊二醛法；
• 碳化二亚胺法； • 活泼酯法； • 亚胺酸酯法； • 卤代硝基苯法。
半抗原与大分子载体的连接
• 半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关。 一般认为至少要有20个以上的半抗原分子连接到 一个载体上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体 。
（二）抗原的分离与纯化
– 是获得高纯度抗原的关键步骤。 – 常用的方法： 1、超速离心法：分离亚细胞及蛋白质大分子。 – 差速离心：指低速与高速交替进行，分离差
别较大的颗粒； – 梯度离心：利用待分离样品中的各种蛋白质
颗粒在密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl） 中的沉降速度不同加以分离。
（二）抗原的分离与纯化
自然凝固（37℃/4℃）——抗血清。
兔：（耳中央静脉），可采 100ml。
• 小鼠：断尾，眼球 采血（<1ml）/摘除 （<2ml）
抗血清的鉴定和保存
鉴定： （1）效价 （2）特异性（双向免疫扩散法） 效价：
– 对倍稀释抗血清 + 纯Ag – 对倍稀释抗血清、Ag（棋盘滴定） 出现沉淀线的抗血清的最高稀释浓度为效价。 特异性 纯度 （SDS-PAGE电泳，条带多需再纯化）
完全抗原
半抗原 或不完全抗原
免疫原性； 免疫反应性
免疫反应性； 无免疫原性
大多数蛋白质、细 菌、病毒等
大多数多糖、类脂、 某些药物等
按来源区分
• 内源性抗原； • 外源性抗原：
– 天然抗原：绝大多数不是单一成分，需要纯化 后制备抗体；
– 人工抗原：半抗原与蛋白载体连接制备成有免 疫原性的化合物；
沉淀（γ球蛋白部分）， 溶解于小量磷酸盐缓冲 液中，装入透析袋。在 磷酸盐缓冲液中平衡透 析至无铵离子析出。 即得到粗制的 IgG。
（二）抗原的分离与纯化
• 3、层析法：
– 离子交换层析： – 利用某些带有一定离子集团的纤维素或凝胶
吸附、交换带相反电荷的蛋白质，将蛋白质抗 原按其所带电荷不同或量的差异，分成不同组 分。 – 凝胶层析（又称分子筛效应）： – 利用凝胶网状结构的孔径大小不同，将蛋白 质按分子量大小不同进行分离。
免疫动物选择
• 种属差异越远越好； • 常用动物： • 小鼠 • 豚鼠或大鼠 • 家兔： • 绵羊或山羊 •马
动物采血法
• 免疫3~5次后，经抗血清鉴定合格，在末次免疫后， 5~7天采血（防Ab下降）。
• 否则应补充免疫1次（肌肉、腹腔，静脉，不加佐 剂），过5~7天再采血。
颈动脉放血法：家兔、山羊（常 用）
淋巴结内微量注射法：
（适用于Ag量少10-100ul，极为宝贵）
• 先 用 IFA （ 羊 毛 脂 + 石 蜡 油 ） 作 足 掌 预 免 疫 ， 10~15天后，将Ag （一般不加佐剂）直接注入肿 大淋巴结（肘窝/腹股沟）。
抗原剂量
• 蛋白质抗原： • 小鼠首次剂量：50-400ug/次； • 大鼠首次剂量：0.1-1mg/次； • 兔首次剂量：0.2-1mg/次； • 细胞抗原： • 羊：不低于1*108； • 兔：不低于1*107，鼠：1*106。
– 合成抗原：合成多肽与蛋白载体连接制备有免 疫原性的物质；
– 基因工程重组抗原：首先获得编码抗原的基因， 然后进行克隆与表达，再纯化抗原。
抗原的提取与纯化
1. 材料预处理 2. 细胞的破碎 3. 抗原的提取 4. 抗原的分离纯化 5. 抗原的浓缩或干燥，保存
天然抗原的提取
• 天然抗原：
– 来源于人类及动物的组织、细胞内及细胞膜的 生物活性物质。
– 溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件下 可以消化细菌和组织细胞。比如，溶菌酶适用
于裂解多种革兰氏阳性细菌，蜗牛酶可以消化
酵母的细胞壁。
– 特点： 作用条件温和；
–
内含物成分不容易破坏；
–
可控制细胞壁的破坏程度。
（一）组织细胞的破碎
• 3、超声破碎法：
– 利用超声波的机械振动使细胞破碎。频率从120kHz，间歇超声破碎（如超声10s，停10s，再 超声10s，停10s，如此反复），避免长期超声 产热破坏抗原。
硫酸铵溶液饱和度为 50％，4℃放置 30 分钟
6000 转/分、15 分钟离心
弃上清液（白蛋白） 重复 3 次
弃上清液（假球蛋 白部分）
沉淀（球蛋白提取部 分），溶解于 2 毫升磷酸 盐缓冲液中
加入 1 毫升饱和硫酸铵 溶液，使硫酸铵溶液饱 和度为 33％
4℃放置 30 分钟 6000 转/分、15 分钟离心
抗原获ຫໍສະໝຸດ Baidu与抗体制备
抗原定义
• 指能够刺激机体免疫系统使之产生特异性 的免疫应答，并能与相应的免疫应答产物， 即抗体和致敏淋巴细胞，在体内外发生特 异性反应的物质。
抗原的两种特性
• 免疫原性：指刺激机体免疫系统，产生特 异性免疫应答的能力。
• 免疫反应性：抗原与相应的免疫应答产物， 抗体和致敏淋巴细胞，在体内外发生特异 性反应的能力。
• 3、改变抗体类型，使由产生IgM转变成IgG； • 4、引起或增强迟发型超敏反应
佐剂的种类
• 1、无机佐剂：氢氧化铝、明矾； • 2、有机佐剂：分枝杆菌、百日咳杆菌和某些细胞
因子； • 3、合成佐剂：双链多聚甘氨酸等； • 4、油剂：福氏佐剂、矿物油、植物油等
• 动物实验中最常用的佐剂。 • 福氏不完全佐剂（IFA）：羊毛脂1份+液状石蜡4
• 优点：无菌操作，节省免疫原 • 缺点：不易乳化完全
鉴定乳化是否完全： • 滴一滴乳化剂到水中，如果不散开漂在水面上说
明乳化完全；如果立即散开说明尚未乳化好。
佐剂增强免疫应答的机制：
• 总的来说就是增强和扩大免疫应答的能力 1.延长Ag的作用时间 2.增强吞噬作用 3.Ag提呈 4.促进细胞因子分泌 5.刺激淋巴细胞增殖，分化
人工抗原的制备
• 半抗原物质的分子量较小，常小于4kD，单独作 用时不具备免疫原性或抗药性弱。必须将它们连 接到大分子载体上才能刺激机体产生抗体。
• 这种半抗原与载体连接后形成的免疫原称为人工 抗原。
大分子载体
• 蛋白质类载体：
• 结构复杂的大分子胶体载体。
• 常用的有： 人血清白蛋白（HSA）、
• 保存：
1．4℃、无菌
2．-20~40℃ 3．冰冻干燥
3~6个月 5年 5~10年
抗血清中Ab的纯化
目的： • 去除杂蛋白 • 去除杂Ab • 去处非同类Ab
特异性IgG的纯化
– 亲和层析法：（特异性IgG） 把需去除的杂蛋白/Ab的交叉Ag交联起来， 过柱，杂蛋白/Ab吸附在柱上，流出的为单价 特异Ab。 – 盐析法（20％硫酸钠沉淀γ球蛋白，其中95
•
牛血清白蛋白（BSA）、
•
兔血清白蛋白（RSA）、
•
牛甲状腺球蛋白（BTG）
• 特点：免疫原性强、容易制备。
大分子载体
• 合成类载体：
• 指人工合成的多肽聚合物。 • 常用的有：多聚赖氨酸，二软脂酰赖氨酸，三软
脂酸-S-甘油半胱氨酸-丝氨酰基丝氨酸等。 • 特点：含有D-丙氨酸结构，与半抗原结合后，不
• 一般认为，佐剂随抗原进入机体后，可改变抗原 的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原缓慢 释放，延长抗原在体内的滞留时间，可以增强和 扩大免疫应答的效应。
佐剂的作用
• 1、增强抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原性的 物质变成有效的免疫原；
• 2、增强机体对抗原刺激的反应性，可以提高初次 应答和再次应答所产生的抗体滴度；
– 如：血细胞抗原；
（一）组织细胞的破碎
• 1、冻融法/冷热交替法：
– 将待破碎的细胞置于-15～-20℃冻结，细胞因突 然受冻，在胞内形成冰晶，再放入30～37℃水 浴中缓慢解冻，反复数次，可使大部分组织细 胞及胞内的颗粒破碎。
– 此法不适用于微生物细胞。
（一）组织细胞的破碎
• 2、酶处理法：
– 一次超声时间为1-2min，总时间在10-15min。 – 此法适用于微生物和组织细胞的破碎。操作简
单，重复性好，时间短。
（一）组织细胞的破碎
• 4、表面活性剂处理法：
– 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表 面活性剂与脂蛋白形成微泡，改变膜的通透性 使之溶解。
– 此法比较温和，提取核酸时常用。 – 常用的表面活性剂： – 十二烷基磺酸钠（SDS） – 吐温 – Triton X-100
凝胶过滤（分子筛效应）
• 亲和层析：
– 利用生物大分子的生物学特性，如抗原和抗体， 配体和受体等之间的特殊亲和力而设计的层析 分离技术。
– 特点：特异性强、操作简单、提取物纯度高， 是纯化抗原常用而有效的方法。
纯化抗原的鉴定
• 含量鉴定：
– 双缩脲法；酚试剂法；BCA（二辛可酸）法；
• 理化性质鉴定：
凝胶层析技术测定蛋白质抗原分子量大小；
• 纯度鉴定：
醋酸纤维素薄膜电泳：利用蛋白所带电荷、 分子量的不同，在电场中泳动加以分开。
免疫活性鉴定：双向免疫扩散等。
纯化抗原的浓缩与保存
• 抗原的浓缩： • 吸收浓缩：利用吸收剂吸收溶液中的溶剂分子
达到浓缩，但对生物大分子不吸收。常用吸收剂 ：聚乙二醇（PEG）、凝胶、蔗糖等。 • 蒸发浓缩：将蛋白转入透析袋，吹风使水分蒸发 而浓缩；
• 2、盐析法：
– 是经典的蛋白质纯化分离技术 – 原理：蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐浓
度的升高而增加，称为盐溶。当盐浓度上升时， 蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并析出， 称为盐析。 – 不同的蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不 同而达到分离。 – 饱和硫酸铵分离球蛋白
血浆或抗血清 1 毫升 加入 1 毫升磷酸盐缓冲液，混匀 加入 2 毫升饱和硫酸铵溶液，边搅拌边滴加
基因工程抗原制备
• 获得编码相应抗原的基因（文库筛选） • 克隆至表达载体中 • 转化入改造过的大肠杆菌内表达蛋白 • 培养细菌至一定数量，收集细菌裂解，获得表达
的蛋白 • 经亲和层析纯化蛋白
佐剂
• 指与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的 特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质，称 为免疫佐剂（immunoadjuvant），简称佐剂（ adjuvant）
份组成，高压灭菌低温保存。 • 福氏完全佐剂（CFA）：每毫升IFA中加入1-20mg
卡介苗。
佐剂乳化
1. 搅拌法：
• 佐剂：羊毛脂+石蜡油（1：5混合，高压灭菌） +卡介苗 加入佐剂搅拌，逐滴加入等量Ag直至 形成白色油包水乳浆。
2. 注射器混合法
• Ag和佐剂来回推注混合直至白色油包水乳液形 成
单克隆抗体的制备
• 单克隆抗体（McAb）：由一个识别一种抗原表 位的B细胞克隆产生的一种化学结构完全相同， 高度均一特异性的抗体即同源抗体。
• 多克隆抗体：Ag分子具有多个表位，每个表位 均可刺激B细胞产生一种特异性Ab，而我们免 疫动物用含多种表位的Ag，所获得的抗血清也 是含有多种Ab的混合物，特异性差，易引起交 叉反应。
• 常用吸收光谱分析法测定偶联到载体上的半抗原 数量。
合成肽抗原制备
• 肽的合成与纯化 • 用化学方法将活化的氨基酸聚合，成为多肽。 • 免疫原性肽的选择 • 常选择对应于蛋白质氨基或羧基端10-15个氨基
酸的短肽，通过化学交联到载体蛋白。
• 合成肽必须与蛋白质载体连接后才可有效 刺激机体产生特异性抗体。
快放法：放血快，动物死亡快
– 在动物颈外侧切开分离颈总动脉，远心 端结扎，近心端止血钳夹住。
– 在结扎处剪断血管，将血管放入瓶中， 慢慢打开止血钳，动脉血喷射入瓶。
心脏采血法：
• 豚鼠、大鼠、鸡（小动物） • 穿刺不准，引起动物急性死亡。
静脉多次采血法：得血量最多 （隔日一次）
• 羊：一次300ml，立即回输10%葡萄糖盐水， 3天后，可采血200~300ml，休息7天，再 加强免疫1次，再可采2次血。总血量： 1500~2000ml。
纯化抗原的浓缩与保存
• 超滤浓缩： • 将纯化的抗原在压力作用下通过一定孔径的滤
膜，溶液与小分子物质可通过滤膜，而大分子则 不能，被保留在膜上。加入小体积的缓冲液溶解 回收。 • 通过超滤，蛋白抗原的稀释液可浓缩到原来的 10～15%，回收达90%以上。
纯化抗原的浓缩与保存
• 浓缩后的蛋白可以封装存储。 • 加入防腐剂：甲苯、氯仿、叠氮钠、硫柳汞等； • 加入稳定剂：甘油、蔗糖等. • 低温干燥保存，0～4度稳定保存数年
需要佐剂就可诱导机体产生针对半抗原的高效价 、高亲和力和高特异性抗体。
半抗原与大分子载体的连接
• 化学法：利用功能基团把半抗原连接到载 体上。
• 戊二醛法；
• 碳化二亚胺法； • 活泼酯法； • 亚胺酸酯法； • 卤代硝基苯法。
半抗原与大分子载体的连接
• 半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关。 一般认为至少要有20个以上的半抗原分子连接到 一个载体上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体 。
（二）抗原的分离与纯化
– 是获得高纯度抗原的关键步骤。 – 常用的方法： 1、超速离心法：分离亚细胞及蛋白质大分子。 – 差速离心：指低速与高速交替进行，分离差
别较大的颗粒； – 梯度离心：利用待分离样品中的各种蛋白质
颗粒在密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl） 中的沉降速度不同加以分离。
（二）抗原的分离与纯化
自然凝固（37℃/4℃）——抗血清。
兔：（耳中央静脉），可采 100ml。
• 小鼠：断尾，眼球 采血（<1ml）/摘除 （<2ml）
抗血清的鉴定和保存
鉴定： （1）效价 （2）特异性（双向免疫扩散法） 效价：
– 对倍稀释抗血清 + 纯Ag – 对倍稀释抗血清、Ag（棋盘滴定） 出现沉淀线的抗血清的最高稀释浓度为效价。 特异性 纯度 （SDS-PAGE电泳，条带多需再纯化）
完全抗原
半抗原 或不完全抗原
免疫原性； 免疫反应性
免疫反应性； 无免疫原性
大多数蛋白质、细 菌、病毒等
大多数多糖、类脂、 某些药物等
按来源区分
• 内源性抗原； • 外源性抗原：
– 天然抗原：绝大多数不是单一成分，需要纯化 后制备抗体；
– 人工抗原：半抗原与蛋白载体连接制备成有免 疫原性的化合物；
沉淀（γ球蛋白部分）， 溶解于小量磷酸盐缓冲 液中，装入透析袋。在 磷酸盐缓冲液中平衡透 析至无铵离子析出。 即得到粗制的 IgG。
（二）抗原的分离与纯化
• 3、层析法：
– 离子交换层析： – 利用某些带有一定离子集团的纤维素或凝胶
吸附、交换带相反电荷的蛋白质，将蛋白质抗 原按其所带电荷不同或量的差异，分成不同组 分。 – 凝胶层析（又称分子筛效应）： – 利用凝胶网状结构的孔径大小不同，将蛋白 质按分子量大小不同进行分离。
免疫动物选择
• 种属差异越远越好； • 常用动物： • 小鼠 • 豚鼠或大鼠 • 家兔： • 绵羊或山羊 •马
动物采血法
• 免疫3~5次后，经抗血清鉴定合格，在末次免疫后， 5~7天采血（防Ab下降）。
• 否则应补充免疫1次（肌肉、腹腔，静脉，不加佐 剂），过5~7天再采血。
颈动脉放血法：家兔、山羊（常 用）
淋巴结内微量注射法：
（适用于Ag量少10-100ul，极为宝贵）
• 先 用 IFA （ 羊 毛 脂 + 石 蜡 油 ） 作 足 掌 预 免 疫 ， 10~15天后，将Ag （一般不加佐剂）直接注入肿 大淋巴结（肘窝/腹股沟）。
抗原剂量
• 蛋白质抗原： • 小鼠首次剂量：50-400ug/次； • 大鼠首次剂量：0.1-1mg/次； • 兔首次剂量：0.2-1mg/次； • 细胞抗原： • 羊：不低于1*108； • 兔：不低于1*107，鼠：1*106。
– 合成抗原：合成多肽与蛋白载体连接制备有免 疫原性的物质；
– 基因工程重组抗原：首先获得编码抗原的基因， 然后进行克隆与表达，再纯化抗原。
抗原的提取与纯化
1. 材料预处理 2. 细胞的破碎 3. 抗原的提取 4. 抗原的分离纯化 5. 抗原的浓缩或干燥，保存
天然抗原的提取
• 天然抗原：
– 来源于人类及动物的组织、细胞内及细胞膜的 生物活性物质。
– 溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件下 可以消化细菌和组织细胞。比如，溶菌酶适用
于裂解多种革兰氏阳性细菌，蜗牛酶可以消化
酵母的细胞壁。
– 特点： 作用条件温和；
–
内含物成分不容易破坏；
–
可控制细胞壁的破坏程度。
（一）组织细胞的破碎
• 3、超声破碎法：
– 利用超声波的机械振动使细胞破碎。频率从120kHz，间歇超声破碎（如超声10s，停10s，再 超声10s，停10s，如此反复），避免长期超声 产热破坏抗原。
硫酸铵溶液饱和度为 50％，4℃放置 30 分钟
6000 转/分、15 分钟离心
弃上清液（白蛋白） 重复 3 次
弃上清液（假球蛋 白部分）
沉淀（球蛋白提取部 分），溶解于 2 毫升磷酸 盐缓冲液中
加入 1 毫升饱和硫酸铵 溶液，使硫酸铵溶液饱 和度为 33％
4℃放置 30 分钟 6000 转/分、15 分钟离心
抗原获ຫໍສະໝຸດ Baidu与抗体制备
抗原定义
• 指能够刺激机体免疫系统使之产生特异性 的免疫应答，并能与相应的免疫应答产物， 即抗体和致敏淋巴细胞，在体内外发生特 异性反应的物质。
抗原的两种特性
• 免疫原性：指刺激机体免疫系统，产生特 异性免疫应答的能力。
• 免疫反应性：抗原与相应的免疫应答产物， 抗体和致敏淋巴细胞，在体内外发生特异 性反应的能力。
• 3、改变抗体类型，使由产生IgM转变成IgG； • 4、引起或增强迟发型超敏反应
佐剂的种类
• 1、无机佐剂：氢氧化铝、明矾； • 2、有机佐剂：分枝杆菌、百日咳杆菌和某些细胞
因子； • 3、合成佐剂：双链多聚甘氨酸等； • 4、油剂：福氏佐剂、矿物油、植物油等
• 动物实验中最常用的佐剂。 • 福氏不完全佐剂（IFA）：羊毛脂1份+液状石蜡4
• 优点：无菌操作，节省免疫原 • 缺点：不易乳化完全
鉴定乳化是否完全： • 滴一滴乳化剂到水中，如果不散开漂在水面上说
明乳化完全；如果立即散开说明尚未乳化好。
佐剂增强免疫应答的机制：
• 总的来说就是增强和扩大免疫应答的能力 1.延长Ag的作用时间 2.增强吞噬作用 3.Ag提呈 4.促进细胞因子分泌 5.刺激淋巴细胞增殖，分化
人工抗原的制备
• 半抗原物质的分子量较小，常小于4kD，单独作 用时不具备免疫原性或抗药性弱。必须将它们连 接到大分子载体上才能刺激机体产生抗体。
• 这种半抗原与载体连接后形成的免疫原称为人工 抗原。
大分子载体
• 蛋白质类载体：
• 结构复杂的大分子胶体载体。
• 常用的有： 人血清白蛋白（HSA）、
• 保存：
1．4℃、无菌
2．-20~40℃ 3．冰冻干燥
3~6个月 5年 5~10年
抗血清中Ab的纯化
目的： • 去除杂蛋白 • 去除杂Ab • 去处非同类Ab
特异性IgG的纯化
– 亲和层析法：（特异性IgG） 把需去除的杂蛋白/Ab的交叉Ag交联起来， 过柱，杂蛋白/Ab吸附在柱上，流出的为单价 特异Ab。 – 盐析法（20％硫酸钠沉淀γ球蛋白，其中95
•
牛血清白蛋白（BSA）、
•
兔血清白蛋白（RSA）、
•
牛甲状腺球蛋白（BTG）
• 特点：免疫原性强、容易制备。
大分子载体
• 合成类载体：
• 指人工合成的多肽聚合物。 • 常用的有：多聚赖氨酸，二软脂酰赖氨酸，三软
脂酸-S-甘油半胱氨酸-丝氨酰基丝氨酸等。 • 特点：含有D-丙氨酸结构，与半抗原结合后，不
• 一般认为，佐剂随抗原进入机体后，可改变抗原 的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原缓慢 释放，延长抗原在体内的滞留时间，可以增强和 扩大免疫应答的效应。
佐剂的作用
• 1、增强抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原性的 物质变成有效的免疫原；
• 2、增强机体对抗原刺激的反应性，可以提高初次 应答和再次应答所产生的抗体滴度；
– 如：血细胞抗原；
（一）组织细胞的破碎
• 1、冻融法/冷热交替法：
– 将待破碎的细胞置于-15～-20℃冻结，细胞因突 然受冻，在胞内形成冰晶，再放入30～37℃水 浴中缓慢解冻，反复数次，可使大部分组织细 胞及胞内的颗粒破碎。
– 此法不适用于微生物细胞。
（一）组织细胞的破碎
• 2、酶处理法：
– 一次超声时间为1-2min，总时间在10-15min。 – 此法适用于微生物和组织细胞的破碎。操作简
单，重复性好，时间短。
（一）组织细胞的破碎
• 4、表面活性剂处理法：
– 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表 面活性剂与脂蛋白形成微泡，改变膜的通透性 使之溶解。
– 此法比较温和，提取核酸时常用。 – 常用的表面活性剂： – 十二烷基磺酸钠（SDS） – 吐温 – Triton X-100
凝胶过滤（分子筛效应）
• 亲和层析：
– 利用生物大分子的生物学特性，如抗原和抗体， 配体和受体等之间的特殊亲和力而设计的层析 分离技术。
– 特点：特异性强、操作简单、提取物纯度高， 是纯化抗原常用而有效的方法。
纯化抗原的鉴定
• 含量鉴定：
– 双缩脲法；酚试剂法；BCA（二辛可酸）法；
• 理化性质鉴定：
凝胶层析技术测定蛋白质抗原分子量大小；
• 纯度鉴定：
醋酸纤维素薄膜电泳：利用蛋白所带电荷、 分子量的不同，在电场中泳动加以分开。
免疫活性鉴定：双向免疫扩散等。
纯化抗原的浓缩与保存
• 抗原的浓缩： • 吸收浓缩：利用吸收剂吸收溶液中的溶剂分子
达到浓缩，但对生物大分子不吸收。常用吸收剂 ：聚乙二醇（PEG）、凝胶、蔗糖等。 • 蒸发浓缩：将蛋白转入透析袋，吹风使水分蒸发 而浓缩；
• 2、盐析法：
– 是经典的蛋白质纯化分离技术 – 原理：蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐浓
度的升高而增加，称为盐溶。当盐浓度上升时， 蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并析出， 称为盐析。 – 不同的蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不 同而达到分离。 – 饱和硫酸铵分离球蛋白
血浆或抗血清 1 毫升 加入 1 毫升磷酸盐缓冲液，混匀 加入 2 毫升饱和硫酸铵溶液，边搅拌边滴加
基因工程抗原制备
• 获得编码相应抗原的基因（文库筛选） • 克隆至表达载体中 • 转化入改造过的大肠杆菌内表达蛋白 • 培养细菌至一定数量，收集细菌裂解，获得表达
的蛋白 • 经亲和层析纯化蛋白
佐剂
• 指与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的 特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质，称 为免疫佐剂（immunoadjuvant），简称佐剂（ adjuvant）
份组成，高压灭菌低温保存。 • 福氏完全佐剂（CFA）：每毫升IFA中加入1-20mg
卡介苗。
佐剂乳化
1. 搅拌法：
• 佐剂：羊毛脂+石蜡油（1：5混合，高压灭菌） +卡介苗 加入佐剂搅拌，逐滴加入等量Ag直至 形成白色油包水乳浆。
2. 注射器混合法
• Ag和佐剂来回推注混合直至白色油包水乳液形 成