9噬菌体效价学习资料

噬菌体效价的测定

一、实验目的

1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系；

2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液方法；

3、学习双层平板法测定噬菌体效价的方法；

4、以局限性转导为例来，学习转导的基本原理；掌握转导实验的基本方法，测定转导率。

二、实验原理

▪细菌转导：由噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。

▪转导可分为局限性转导和普遍性转导两大类。

普遍性转导：

▪噬菌体能转导供体细菌的任何基因；

如鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠

杆菌的P1噬菌体、枯草杆菌的PBS1、

PBS2、SP10噬菌体等；

▪其机制在于这些噬菌体可以整合在供

体菌染色体DNA的任何位置上。

P22噬菌体

局限性转导：

噬菌体只能转导供体菌染色体DNA上的某些特定基因；

如λ噬菌体只能转导供体菌E.coli K12染色体上的半乳糖基因和生物素基因。

产生局限性转导的原因在于这些噬菌体仅能整合在供体菌染色体DNA的特定位置上。

λ(dgal +

)

λ(dbio +)

λ原噬菌体

▪转导实验中常用的是λ噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA 上的半乳糖基因（gal ）和生物素基因(bio) 之间，因此，它能转导gal 基因又能转导bio 基因。

噬菌体的溶原

▪温和噬菌体侵染细胞后整合到宿主的染色体组中，使宿主细菌成为溶源性细菌。

▪溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具有感染力的噬菌体。可以用物理或化学的方法诱导，使

其大部分或全部裂解。

▪检测时需要有对此温和噬菌体敏感的细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体，被称为受体菌。

λ(dgal +)λ

裂解液中λ(dgal +)(转导噬菌体)占50%λ(正常噬菌体)占50%

宿主菌染色体

供体菌E.coli k 12

(λ) gal

+▪是一种双重溶源菌

▪此菌中λ噬菌体与gal +基因紧密连锁，当其受紫外线照射后即产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有gal 基因的转导噬菌体和完整噬菌体。

本实验所用的供体菌

λ(dgal +) E. coli K 12

S gal －

E. coli K 12S gal －受体菌

受体菌

λ

半乳糖EMB 培养基

gal +

gal 转导子

gal

-受体菌：E.coli K 12(s) gal

-▪与带gal 基因的噬菌体、混合接触时，能以一定的频率整合到受体菌上，从而

使不能利用半乳糖的gal-受体菌转变成能利用半乳糖的gal+细菌。▪通过转导噬菌体获得gal+基因的受体菌称为gal 转导子

▪gal 转导子因能利用半乳糖而产生大量

酸，在EMB 培养基上使指示剂显紫色,并带有金属光泽，其他菌因不能利用半乳糖，在EMB 培养基上显示为粉白色。

实验中选用携带λ/dλ噬菌体的大肠杆菌（双重溶源性菌株）。该菌株同时被λ完整噬菌体和λ缺陷噬菌体(dλ)

侵染。可以用于高频转导。

转导子

裂解菌体形成噬菌斑

噬菌斑

当其侵入寄主细胞后在其内不断增殖与

裂解、释放、再感染其周围敏感细胞，

再在其内不断增殖与裂解、释放等多次

重复，最终使含有敏感菌的菌悬液由混

浊逐渐变清，或在双层琼脂平板上形成

肉眼可见的噬菌斑。

噬菌体效价

▪噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。

▪效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此能进行噬菌体的计数。

▪噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低，因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Forming Units, PFU）表示。

双层法操作要点

先在无菌培养皿中倒一层营养琼脂培养基待凝后作底层用；再将合适稀释度的噬菌体液与培养至对数期的相应敏感菌混匀，待噬菌体粒子充分吸附并侵入细胞后，加入半固体营养琼脂培养基迅速搓匀，立即倒在底层培养基的表面铺平，待凝固后进行培养。凡具有感染力的噬菌体粒子，即可在平板表面菌苔上形成一个个透明的噬菌斑。

双层法的优点：形成的噬菌斑的形态、大小较一致，清晰度较高，计数也比较准确，因而被广泛应用。

三、实验器材

▪菌种

供体菌：E.Coli k 12(λ) gal +；受体菌：E.Coli k 12S gal -

▪培养基

EMB 培养基（1L ）：半乳糖10g 、蛋白胨10g 、K 2HPO 42g ，2%伊红Y20ml 、0.5%美蓝13ml 、琼脂20g ，pH 7.4；（若半乳糖被分解产酸，指示剂变色使菌落成深紫色金属光泽；若不被分解，则成浅粉色）LB 培养基，素琼脂(0.5%软琼脂）

▪试剂仪器

Eppendorf 管，移液器，水浴锅，振荡器，酒精灯等。

四、实验步骤

1. 菌种活化

于前一天晚上18:00分别接种供体菌和受体菌于5ml LB液体培养基,37℃摇床培养过夜。取该培养液1:50转接入新鲜LB培养基，再次活化培养3h。

2. 供体菌的诱导

取供体菌2ml以5000rpm离心5min，弃上清，加2ml PBS制成菌悬液，再离心，重复洗涤3次，加入1ml PBS混匀，转到无菌小皿中，紫外线照射诱导（15瓦，灯距40cm）20s，加入2ml LB液，37℃避光（报纸包起来）培养2-3h。

请使用涡旋混合