第十八章基因诊断与基因治疗

4
三.
基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术
聚合酶链反应（PCR）技术
生物芯片
基因测序
5
（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交
是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条 单链核酸分子形成稳定双链的过程。
基本原理： 碱基互补、变性和复性 碱基互补 变性：
升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链； DNA与DNA杂交： DNA与RNA杂交: A=T、 G≡C ; A=U、 G≡C ;
探针标记物
有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素 等）两大类。
8
1.核酸分子杂交的分类 液相杂交
待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中 进行杂交反应；
固相杂交 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶 液中的特异性探针进行杂交反应。
常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
9
模板DNA 扩增倍数T=2n (n:
循环次数)。
21
2.
PCR各要素及其作用
PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝； RNA作为模板时，需要：
（1） 模板
RNA 逆转录 cDNA
PCR, 称此为RT-PCR.
（2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种 DNA聚合酶，可在95℃稳定 30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 52℃退火→72℃延伸]
原位杂交（ hybridization in situ）
11
(1) Southern 印迹杂交法
限制性内切酶酶切
检测杂交信号
提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片段,进 12 行基因定位、分子量测定等。
（2）Northern 印迹杂交法
（其基本过程类似于上述Southern法）
20
（3）引物延伸
将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。
以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）
（新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循 环 ，PCR产物呈指数扩增。
第十八章 基因诊断与基因治疗
(gene diagnosis and therapy)
本章主要内容
基因诊断 基因治疗
2
第一节
基 因 诊 断
一.
基因诊断概念
利用分子生物学方法，直接检测基因结 构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出 诊断,为治疗提供依据。
3
二.
基因诊断特点：
针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广
优点：
缺点：
简便、快速、灵敏、样本用量少；
特异性不高，有一定比例的假阳性。
用途：
检测样本中存在的微量DNA或RNA
14
（4）菌落杂交
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
15
（5）夹心杂交法
RE
A A A
片断A 检测探针
RE
B B
片段B捕捉探针
B
固 相 支 持 物
本法优点：
16 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
10
3. 常用固相核酸杂交方法
Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）
Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sandwich hybridization）
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→
转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影
或显色→检测信号。
Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA
13
（3）斑点杂交或狭缝杂交法
基本过程：
将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记 探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结 果。
PCR是利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质， 在体外对目的基因DNA进行大量扩增的技术。
1.
PCR基本原理：
PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buf.等条件下，用
耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引
物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的 反复循环 （2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增 。
（6）原位杂交
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交
有
DNA-DNA
RNA-DNA RNA-RNA
三类杂交
该法优点：
不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而 更能准确地反映组织细胞的功能状态。 17
（二）聚合酶链反应（PCR）技术
18
PCR技术原理示意图
（ 94℃左右）
Leabharlann Baidu
（52℃左右）
（72℃左右）
19
（1）DNA模板的热变性
将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成 为单链，并游离于反应体系中作为模板。
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入
的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。
复性：
缓慢降低温度（ 52℃左右），变性的两条单链重新形成互 补双链。
6
• DNA:DNA
hybridization 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
7
DNA:RNA
RNA:RNA
利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已
知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核 酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。
核酸探针
是指带有标记的、并已知碱基序列的DNA或RNA片段，能与
待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。
循环30次过程中不变性失活。
22
（3）引物
引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的