23第二十三章 药物特殊毒性研究

乙烯雌酚 20-80μ g
遗传毒性 内容：
致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
第一节 药物的遗传毒性
遗传毒性研究（Genotoxicity Study） 是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒 理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的 联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显 表 人类与动物致畸剂量比较 最低致畸剂量（/kg/d) 人 人与动物比值 动 物
定
量
药物
反应停
氨基喋呤 氨甲喋呤 苯妥英钠
0.5-1.0mg 兔
50μ g 42μ g 2mg
2.5mg
5-2.5
2 4.8 10-2.5 25
差
异
大鼠 100μ g 大鼠 200μ g 恒河猴 200μ g 小鼠 50mg
来自百度文库
对照设置：溶剂——阴性对照 （DMSO
或者乙醇）已知致突变原——阳性对照 菌株鉴定： 组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定
uvrB缺失的鉴定
R因子鉴定
基因型鉴定
肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1）S9诱导：多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip （2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆 清即为S9。 （3）S9混合液：平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）。 4 ℃，9000g，离心10min 上
试验方法
（标准平皿掺入法）：
顶层琼脂＋测试菌株、 受试物、S9混合液
底层琼脂培养基平皿
固化 （点试法）： 37 ℃，培养48h 菌落计数
结果评价：
Rt/Rc≥2，并有量效关系，判为阳性。 滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。
2
哺乳动物培养细胞染色体畸变
2018/4/24
细胞：CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。
20～50％
﹥50％
中度阳性（＋＋）
强阳性（＋＋＋）
•注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验
正 常 染 色 体
畸 变 染 色 体
建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期检查核型和有
无支原体等污染，-80℃或液氮冻存。
剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，最高 不要超过10mM分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中 低剂量用倍量稀释法，至少３个剂量。
对照：
阴性对照——溶剂 阳性对照——已知致突变剂 Ｓ９对照： 代谢活化：肝微粒体酶S9系统,应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体 酶（S9）进行体外代谢活化试验。 时间：药物作用时间: 药物和细胞接触非活化组作用24h和48h收获细胞,
遗传毒性试验方法分类：
微生物回复突变试验
基因突变 哺乳动物培养细胞基因突变试验
果蝇伴性隐性致死试验 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 染色体畸变 啮齿类动物微核试验 检测终点 啮齿类动物显性致死试验 精原细胞染色体畸变试验 程序外DNA合成试验 DNA损伤与修复 姐妹染色单体交换试验
SOS显色试验
药物的遗传毒性研究
致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长
形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经 诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。 S9混合液：
鼠伤寒沙门菌His+ （野生型）
正向突变 回复突变
鼠伤寒沙门菌His－ （突变型） S9混合物 受试物
代谢活化组作用6小时以上
标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和48h收获细胞（在 1.5个细胞周期时收获细胞，若为阴性结果，作用时间可大于1.5个细胞周期 )
（2）读片分析：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录染色体的
结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型。 包括：染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙多倍体的出现 结果判定：细胞畸变率＝有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数×100 细胞畸变率 ﹤5％ 5～10％ 10～20％ 结果判断 阴性（－） 可疑（±） 弱阳性（＋）
临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险。
药物的遗传毒性研究 遗传毒性和
致突变：联
系、区别
目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可 以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不 添加代谢活化物质的试验，也可在整体动物上进行体内试验。 分类： 根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类: 基因突变 染色体畸变 DNA损伤与修复 从试验系统来分: 体内试验 体外试验
第 十五 章 药物特殊毒性研究
目的和意义：
研究对遗传物质是否有损伤，是否会 引起肿瘤、衰老及畸胎等。
特点： 特殊毒性试验存在着种属差异性：
定性差异
定量差异
定性差异
反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少对10种品系大鼠、 15种品系小鼠、2种家狗、３种田鼠和８种灵长类动物不致畸 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致畸 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却引起脸和内脏畸形
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作
用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
药物的遗传毒性研究
遗传毒性试验：指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗
传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤
及其损伤的固定 。
遗传毒性试验的用途：主要用于致癌性预测。
遗传毒性试验的目的：预测受试物是否有遗传毒性，降低
试验菌株：TA97、TA98、TA100和TA102 剂量设计： （1）受试物至少应有5个剂量。 （2）最低剂量：1 g/皿或0.1 （3）最高剂量： 可溶、无毒：5mg/皿 g/皿
可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿
难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿
难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过5mg/皿
推荐的标准试验组合：
（1）一项体外细菌基因突变试验。
（2）一项用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤
评估试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验。 （3）一项用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色 体损伤试验。
1 鼠伤寒沙门菌回复突变试验
微生物回复突变试验 原理：鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故 在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有