α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测解读
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实验6 α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用的检测
酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性. 现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。 然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些 实际问题： （1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回 收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。
（四）、交联法
是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋 白的氨基相连得到三维的交联网状结构
氨基相连处
酶的固定化方法
酶 物理吸附法
交联法
包埋法
固定化酶的性质
• 稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化： 可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定 • 底物的专一性变化：
2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度
的因素:
1、pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附 面积的大小。
讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后 再接收流出液用于鉴定？
答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉 反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于 反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所 以不利于后面的颜色鉴定。
2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀 粉酶？ 答案：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加 入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管 增加温度，几分钟后加入1～２滴KI-I2指示剂， 如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶 液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀 粉酶的固相酶作用的结果。
3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越 好，这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是 一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失 活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。 寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀 粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。 在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素 发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀 粉酶用途广泛。
怎样解决这些问题呢？
——固定化酶技术
一、酶与固定化酶
• 酶 活细胞产生的具有生物催化作用的
生物大分子。
• 固定化酶 (固相酶)
将水溶性的酶用物理或化学 的方法固定在某种介质上， 使之成为不溶于水而又有酶 活性的制剂。
• •
•
•
Fra Baidu bibliotek
固定化酶的优点 （1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反 应的过程可管道化、连续化和自动化； （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易 纯化； （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工 厂化生产； （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间 贮存和使用；
淀粉 α-淀粉酶 糖化淀粉酶 β -淀粉酶 糊精 麦芽糖 葡萄糖
三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
遇碘显蓝色
遇碘显红色
遇碘不显色
3、设备及用品： 5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气 门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支 4、实验材料及其制备 （1） α-淀粉酶的固定化： 5mgα-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂，搅拌，30min →装入层析柱→10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流 速为1ml/min（约20滴） （2）可溶性淀粉溶液： 50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。 （3）5mmol/L KI-I2溶液 0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解后 装入滴瓶中。
1、实验目的： （1）制备固定化α淀粉酶； α -淀粉酶： 枯草杆菌的 最适pH5.5～7.5 （2）进行淀粉水解的测定。 最适温度55～75℃ 2、实验原理： 用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓 度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成 糊精。用淀粉指示剂溶液（KI－I2）测试，流出物 呈红色，表明水解产物糊精生成。
1、根据吸附剂的特点分为两种：
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用 力将酶吸附于固体吸附剂 的方法.如有机硅胶、活性 炭和石英砂等 利用酶的两性基团和离子 交换剂的相互作用（离子 键）。吸附量大
离子结合法
（二）、包埋法
将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型 或包埋成微胶囊型
（三）共价偶联法
是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是 酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体 共价结合，形成共价键，从而被固定化。
5、实验步骤：
将注射器固定在注射器架上 用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢）
流出5ml后接收0.5ml（约10滴）流出液 加入1~2滴KI-I2溶液，观察颜色 用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较） 实验后，10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中 几天后重复实验，观察结果
固定化酶的不足之处 不能催化一系列反应
二、酶的固定化
• 方法： 吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
•目的： 水溶性酶 物理、化学方法 不溶于水且有酶活性 • 机理： 将固定化酶装柱，当底物经过该柱时， 在酶的作用下转变为产物。
(一)、吸附法
吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤 除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简 单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。
6、实验结果： • 淀粉溶液+指示剂： 呈蓝色 • 亲和层析洗脱液+指 示剂： 呈红色 • 贮于冰箱几天后重 复实验： 呈红色
固定化酶的用途
在工业上的应用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。
在化学分析和临床诊断上的应用： 用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。 在医药上的应用： 将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到 患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛 腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。
酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性. 现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。 然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些 实际问题： （1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回 收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。
（四）、交联法
是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋 白的氨基相连得到三维的交联网状结构
氨基相连处
酶的固定化方法
酶 物理吸附法
交联法
包埋法
固定化酶的性质
• 稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化： 可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定 • 底物的专一性变化：
2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度
的因素:
1、pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附 面积的大小。
讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后 再接收流出液用于鉴定？
答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉 反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于 反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所 以不利于后面的颜色鉴定。
2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀 粉酶？ 答案：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加 入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管 增加温度，几分钟后加入1～２滴KI-I2指示剂， 如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶 液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀 粉酶的固相酶作用的结果。
3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越 好，这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是 一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失 活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。 寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀 粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。 在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素 发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀 粉酶用途广泛。
怎样解决这些问题呢？
——固定化酶技术
一、酶与固定化酶
• 酶 活细胞产生的具有生物催化作用的
生物大分子。
• 固定化酶 (固相酶)
将水溶性的酶用物理或化学 的方法固定在某种介质上， 使之成为不溶于水而又有酶 活性的制剂。
• •
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Fra Baidu bibliotek
固定化酶的优点 （1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反 应的过程可管道化、连续化和自动化； （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易 纯化； （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工 厂化生产； （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间 贮存和使用；
淀粉 α-淀粉酶 糖化淀粉酶 β -淀粉酶 糊精 麦芽糖 葡萄糖
三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
遇碘显蓝色
遇碘显红色
遇碘不显色
3、设备及用品： 5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气 门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支 4、实验材料及其制备 （1） α-淀粉酶的固定化： 5mgα-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂，搅拌，30min →装入层析柱→10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流 速为1ml/min（约20滴） （2）可溶性淀粉溶液： 50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。 （3）5mmol/L KI-I2溶液 0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解后 装入滴瓶中。
1、实验目的： （1）制备固定化α淀粉酶； α -淀粉酶： 枯草杆菌的 最适pH5.5～7.5 （2）进行淀粉水解的测定。 最适温度55～75℃ 2、实验原理： 用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓 度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成 糊精。用淀粉指示剂溶液（KI－I2）测试，流出物 呈红色，表明水解产物糊精生成。
1、根据吸附剂的特点分为两种：
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用 力将酶吸附于固体吸附剂 的方法.如有机硅胶、活性 炭和石英砂等 利用酶的两性基团和离子 交换剂的相互作用（离子 键）。吸附量大
离子结合法
（二）、包埋法
将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型 或包埋成微胶囊型
（三）共价偶联法
是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是 酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体 共价结合，形成共价键，从而被固定化。
5、实验步骤：
将注射器固定在注射器架上 用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢）
流出5ml后接收0.5ml（约10滴）流出液 加入1~2滴KI-I2溶液，观察颜色 用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较） 实验后，10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中 几天后重复实验，观察结果
固定化酶的不足之处 不能催化一系列反应
二、酶的固定化
• 方法： 吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
•目的： 水溶性酶 物理、化学方法 不溶于水且有酶活性 • 机理： 将固定化酶装柱，当底物经过该柱时， 在酶的作用下转变为产物。
(一)、吸附法
吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤 除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简 单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。
6、实验结果： • 淀粉溶液+指示剂： 呈蓝色 • 亲和层析洗脱液+指 示剂： 呈红色 • 贮于冰箱几天后重 复实验： 呈红色
固定化酶的用途
在工业上的应用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。
在化学分析和临床诊断上的应用： 用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。 在医药上的应用： 将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到 患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛 腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。