蛋白浓度的测定

蛋白质浓度测定：紫外分光光度法

OD280/OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：

样本蛋白质含量(mg/m1)＝1.45*OD280一0.74*OD260

OD280/OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：

样本蛋白质含量(mg/m1)= OD280/K×L＝（OD280/6.3×1）×10g/L 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml/cm.g）

K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；

注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白

质氨基酸组成应相似，以减小误差。

OD是optical density（光密度）的缩写， OD＝1og（1/trans），其中trans 为检测物的透光值。

吸光度：吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

吸光度用A表示， A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/（g·cm），b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L。影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。

A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8~2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260和A280读数；同时，对同一样品10倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当A260读数处在0.1-0.5 之间，A200 到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚（30 ul/ml）残留使A230，A260，A280均变大（差不多增加一倍），但A260/A280和A260/A230均在2左右。

少量异硫氰酸胍（132 uM）残留使A230变大，但A260，A280几乎不变，所以A260/A280仍在2左右，而A260/A230大大低于2。大量异硫氰酸胍（2.4 M）残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。PEG（6.25%）残留使A230，A260，A280均变大，但对A230，A260影响更大，所以A260/A280比2大不少，而A260/A230仍在2左右。

核酸抽提中常用的试剂，如Phenol，GuanidineIsothiocyanate，PEG都能使A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280和A230。干净的核酸A260/A230应该在2左右。如果有在230 nm 处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物

1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1~0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10 mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

比值低可能有蛋白污染，高了可能有DNA污染，建议你抽提的RNA分三管，两管保存，另一管用来跑胶和测定OD，跑胶是最直观的，1%的胶就可以，抽提后马上跑，一般不会降解很多，所以设备材料不需要去酶处理不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测，这样就会上来了

蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。

情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：

OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。

样品中如果含有蛋白质及苯酚，A

260/A

280

比值会明显下降。对于纯的样品只

要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD

260/OD

280

≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚

等污染）

纯RNA：1.9

260/OD

280

<2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA 其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。

一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。

纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品，只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）